本文關(guān)鍵詞：采用斑馬魚建立可誘導(dǎo)顯性突變體篩選體系

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【摘要】：傳統(tǒng)的正向遺傳篩選主要包括輻射誘變,化學(xué)誘變和DNA插入誘變等基因突變方法。這幾種誘變方法所產(chǎn)生的絕大多數(shù)突變會(huì)讓基因喪失全部或部分功能,極少情況下產(chǎn)生功能獲得性突變。正向遺傳篩選已在揭示各種生命復(fù)雜過程的分子機(jī)制中起著重要的作用。但它還有一定的局限性,如：這些誘變方法所產(chǎn)生的突變體一般為隱性突變,所以需要經(jīng)過三代才獲得純合突變體,占用空間,耗費(fèi)時(shí)間,消耗勞動(dòng)力；其次,基因的異位表達(dá)同樣對(duì)基因功能研究非常重要,這也是傳統(tǒng)篩選體系所缺乏的；特別是,很多基因在胚胎發(fā)育中起重要的作用,純合突變體早期胚胎致死,因此不能利用這些突變體研究其基因在成體各種過程中的功能,如：器官再生,行為產(chǎn)生等。由于傳統(tǒng)正向遺傳篩選的這些缺陷,急需建立新的遺傳篩選體系。斑馬魚不僅由于養(yǎng)殖方便,繁殖周期短,產(chǎn)卵量大,體外受精,體外發(fā)育,胚胎透明等,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于早期胚胎發(fā)育研究,并且由于它的大多數(shù)器官如：尾鰭,心臟,肝臟,側(cè)線,脊椎等都能再生,所以越來越多的科學(xué)家利用斑馬魚來研究器官再生分子機(jī)制�；瘜W(xué)誘變和DNA插入誘變等正向遺傳篩選方法的建立讓斑馬魚成為很好的遺傳模式體系。本項(xiàng)研究將利用斑馬魚構(gòu)建可誘導(dǎo)顯性突變體篩選體系。新的篩選體系既可用來在F1代胚胎期篩選早期發(fā)育缺陷突變體,也可用來篩選F1代成魚尾鰭再生缺陷突變體。其基本原理為：To12介導(dǎo)的Tet-on啟動(dòng)子隨機(jī)插入斑馬魚的基因組,當(dāng)Tet-on啟動(dòng)子正向插入某個(gè)基因的5’端,在四環(huán)素處理下,此目標(biāo)基因?qū)?huì)被過量表達(dá)；當(dāng)Tet-on啟動(dòng)子反向插入某個(gè)基因的內(nèi)部時(shí),在四環(huán)素處理下,此目標(biāo)基因的反義RNA將會(huì)被激活表達(dá),目標(biāo)基因?qū)?huì)被敲低。從700個(gè)FO斑馬魚中,我們篩選到了300個(gè)轉(zhuǎn)基因系,在此300個(gè)轉(zhuǎn)基因系的中,我們共篩選到了27個(gè)突變體,其中20個(gè)突變體僅呈現(xiàn)早期胚胎發(fā)育缺陷,3個(gè)突變體僅首先呈現(xiàn)尾鰭缺陷,4個(gè)突變體呈現(xiàn)兩種缺陷。在此27個(gè)突變體中,共鑒定出58個(gè)基因其中包括8個(gè)非編碼基因,在四環(huán)素處理下,大部分基因被誘導(dǎo)敲低,少部分基因被誘導(dǎo)過量表達(dá)。此58個(gè)基因其中包括一些已知的基因如：fafl,grbl4, pcytlaa,nidogen2, sgcd, ap2bl等,這些基因突變體在胚胎期的表型與已發(fā)表研究結(jié)果類似。我們研究證明可誘導(dǎo)顯性突變體篩選體系是一個(gè)非常有效的遺傳篩選體系。綜上所述,本課題建立了一種新型的遺傳篩選體系,特別適用于成體突變體的篩選,是對(duì)傳統(tǒng)篩選體系的很好補(bǔ)充。此外,該系統(tǒng)還可以應(yīng)用于其他物種,特別是小鼠的正向遺傳篩選,因?yàn)樾∈蟮膫鹘y(tǒng)正向遺傳篩選,需要大量的空間,設(shè)施,一般實(shí)驗(yàn)室很難進(jìn)行。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1302286