發(fā)布時(shí)間：2017-12-17 04:17

  本文關(guān)鍵詞：亞油酸異構(gòu)酶相關(guān)性及定向進(jìn)化菌株構(gòu)建和酶性質(zhì)的研究

  更多相關(guān)文章： 亞油酸異構(gòu)酶 定向進(jìn)化 基因工程菌 酶學(xué)性質(zhì)

【摘要】：共軛亞油酸(Conjugated Linoleic Acid,CLA)是一類(lèi)由不同位置和幾何異構(gòu)體組成的擁有兩個(gè)共軛雙鍵的十八碳二烯酸。它廣泛存在于多種食物中,CLA具有多種生理活性,但不同類(lèi)型的CLA生理活性不盡相同。本研究從兩種亞油酸異構(gòu)酶的克隆表達(dá)入手,比較兩者差異,探索一種通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)與綠色熒光蛋白標(biāo)簽質(zhì)粒聯(lián)合篩選正突變子的快速篩選方法,優(yōu)化突變酶的產(chǎn)酶條件,提高t10,c12-CLA產(chǎn)量,研究突變酶的分離純化條件和酶學(xué)性質(zhì),并將其應(yīng)用于發(fā)酵乳中�？寺×藘煞N亞油酸異構(gòu)酶基因lai-l(ORF1776bp)和lai-p(ORF1275bp)。測(cè)序后比對(duì)發(fā)現(xiàn),它們與相應(yīng)的羅伊氏乳桿菌和痤瘡丙酸桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因相似性為100%,說(shuō)明兩段基因未發(fā)生突變。lai-l與瑞士乳桿菌和加氏乳桿菌的亞油酸異構(gòu)酶基因相似性為93%,兩段基因彼此之間同源性很低。lai-l編碼591個(gè)氨基酸,蛋白命名為L(zhǎng)AI-L,分子量為67.9k D,等電點(diǎn)p I=7.14,預(yù)測(cè)為親水性穩(wěn)定蛋白。它有11個(gè)Ser,8個(gè)Thr,8個(gè)Tyr可能成為蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn),可能是膜上的受體或者定位于膜上;二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以不規(guī)則卷曲為主達(dá)47.88%,α-螺旋占34.86%,β-折疊占17.26%。lai-p編碼424個(gè)氨基酸,蛋白命名為L(zhǎng)AI-P,分子量為49.0k D,等電點(diǎn)p I=4.81;預(yù)測(cè)為親水性不穩(wěn)定蛋白。它有3個(gè)Ser,4個(gè)Thr,7個(gè)Tyr可能成為蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn),該蛋白應(yīng)該是細(xì)胞外蛋白;二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以不規(guī)則卷曲為主達(dá)45.28%,α-螺旋占36.32%,β-折疊占18.4%。將兩種亞油酸異構(gòu)酶分別在大腸桿菌中表達(dá),表達(dá)的蛋白LAI-L和LAI-P大小約為64k D和55k D;利用易錯(cuò)PCR法突變lai-p,構(gòu)建標(biāo)簽表達(dá)載體p Cold-yclai-p-gfp,結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)篩選正突變菌株,準(zhǔn)確率達(dá)82.3%(其中7株突變菌的亞油酸異構(gòu)酶的蛋白序列改變了一個(gè)氨基酸;4株突變菌的蛋白序列改變了2個(gè)氨基酸;M955蛋白序列改變了4個(gè)氨基酸,共發(fā)生7個(gè)堿基位點(diǎn)的突變)。其最佳誘導(dǎo)時(shí)間為18h,最佳誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.2mmol/L,經(jīng)氣相色譜鑒定M955產(chǎn)t10,c12-CLA,產(chǎn)量為68.3±2.1μg/m L。突變亞油酸異構(gòu)酶最佳發(fā)酵時(shí)間為18h,最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2mmol/L,最佳裝液量為20%,最佳培養(yǎng)基初始p H為7,最佳誘導(dǎo)前生物量為OD600=0.4,最佳底物濃度為0.5mg/m L,最佳離子濃度為0.02%的離子。響應(yīng)曲面法優(yōu)化最佳產(chǎn)酶條件為發(fā)酵時(shí)間19.5h,誘導(dǎo)前生物量OD600=0.47和LA濃度0.57mg/m L,亞油酸異構(gòu)酶催化LA轉(zhuǎn)化為CLA最大量為143.33μg/m L。采用親和層析法對(duì)突變酶進(jìn)行分離純化,最佳流速為0.25 m L/min,最佳上樣量為10 m L,純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)可達(dá)到電泳純。研究突變酶的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn):米氏方程為y=0.0224x+0.0786 R2=0.9972,計(jì)算得Km為0.285mg/m L,Vmax為12.72U/mg。酶的最適反應(yīng)溫度為37℃、溫度穩(wěn)定范圍為0~40℃、最適反應(yīng)p H為7.0、p H穩(wěn)定范圍為p H5.0~9.0之間、最佳底物濃度為0.5mg/m L、金屬離子對(duì)亞油酸異構(gòu)酶的活性沒(méi)有顯著影響。將未突變和突變后的痤瘡丙酸桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化到嗜熱鏈球菌中。研究發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌紅霉素的敏感閾值為7.5μg/m L,當(dāng)甘氨酸濃度為1%、菌體生長(zhǎng)至OD600=0.8、轉(zhuǎn)化電壓為1.8k V、質(zhì)粒濃度為1.0μg/μL、電轉(zhuǎn)緩沖液選擇bufferⅡ時(shí)電轉(zhuǎn)化效率最高。轉(zhuǎn)化菌發(fā)酵乳的性質(zhì)除發(fā)酵時(shí)間比正常菌慢10%之外,其他性質(zhì)如質(zhì)構(gòu)、粘度、粒徑均與正常嗜熱鏈球菌沒(méi)有差別,檢測(cè)發(fā)酵乳中CLA含量:轉(zhuǎn)化菌(lai)催化LA產(chǎn)t10,c12-CLA=7.2μg/m L,轉(zhuǎn)化菌(yclai)催化LA產(chǎn)t10,c12-CLA=30.2μg/m L。異源表達(dá)的突變亞油酸異構(gòu)酶具有較強(qiáng)的產(chǎn)CLA的能力,因此該酶具有廣闊的發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：Q936
，

本文編號(hào)：1298708