本文關(guān)鍵詞：螺旋藻抗菌肽的純化鑒定及其抑菌機(jī)理的研究

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【摘要】：螺旋藻(Spirulina)屬于原核生物,是藍(lán)藻門顫藻科螺旋藻屬。螺旋藻生長(zhǎng)迅速,生物量大,蛋白質(zhì)含量高,以螺旋藻為制備活性肽的來源,有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。本研究從螺旋藻蛋白酶解物中提取、分離及篩選抗菌肽并對(duì)其結(jié)構(gòu)和生化特性進(jìn)行了鑒定,并全面剖析了抗菌肽SP-1對(duì)大腸桿菌的抑菌作用機(jī)理,主要結(jié)果如下：(1)螺旋藻蛋白經(jīng)堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解后,利用Sephadex G-25凝膠層析、C18反相高效液相層析、Superdex 75 10/300柱層析分離純化后,得到具有抑制革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)和革蘭式陽性菌(金黃色葡萄球菌)的純化組分,將其命名為SP-1。采用MALDI-TOF/TOF-MS以及LTQ串聯(lián)質(zhì)譜的方法對(duì)螺旋藻抗菌肽SP-1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定, 最終確定SP-1為18個(gè)氨基酸(KLVD ASHRLATGDVAVRA)組成的陽離子小分子肽,分子量約為1878.97 Da。利用瓊脂擴(kuò)散法確定了純化組分SP-1對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有較強(qiáng)的抑菌活性,其中,SP-1對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC值)為8mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC值)為16mg/mL,且在較高濃度時(shí)(8×MIC值)仍無溶血活性,SP-1在一定濃度范圍內(nèi)使用時(shí)對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞不具有毒性,特異性高。(2)通過圓二色譜分析抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,研究發(fā)現(xiàn)SP-1在水溶液中以無規(guī)則卷曲構(gòu)象為主(無規(guī)則卷曲含量58.1%),當(dāng)它置于仿膜疏水環(huán)境時(shí)能夠調(diào)整為以β-折疊結(jié)構(gòu)為主的二級(jí)結(jié)構(gòu),β-折疊含量為57.2%。以大腸桿菌為指示菌,對(duì)螺旋藻抗菌肽SP-1的抑菌機(jī)理進(jìn)行研究,結(jié)果表明抗菌肽SP-1能夠迅速包圍菌體,作用于細(xì)胞表面,發(fā)生聚集現(xiàn)象,使大腸桿菌的細(xì)胞外膜和細(xì)胞質(zhì)膜的通透性變大,且對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的透化作用更強(qiáng),并隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),破壞細(xì)胞膜完整性,導(dǎo)致胞內(nèi)的離子(K+)泄漏,最終在細(xì)胞膜上穿孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,說明細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)是抗菌肽SP-1攻擊的首要靶位點(diǎn)。凝膠阻滯試驗(yàn)結(jié)果顯示,SP-1進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后可與大腸桿菌基因組DNA結(jié)合,結(jié)合能力與抗菌肽SP-1的濃度呈正相關(guān),說明SP-1能夠進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)累積,其作用靶標(biāo)是DNA。SP-1與大腸桿菌DNA作用后,首先影響的是基因的轉(zhuǎn)錄功能,使大腸桿菌細(xì)胞周期中Ⅰ期(G1期)細(xì)胞數(shù)目顯著增加,說明抗菌肽SP-1首先抑制了細(xì)菌的RNA的合成,進(jìn)而抑制了細(xì)菌DNA的合成,最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。本研究分離純化得到的螺旋藻抗菌肽SP-1,通過破壞大腸桿菌的細(xì)胞膜,阻斷其RNA的轉(zhuǎn)錄和DNA的合成而導(dǎo)致細(xì)菌的死亡,從而在細(xì)胞和分子水平明確了螺旋藻抗菌肽SP-1對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的抑制作用。本研究結(jié)果為天然防腐劑及抗生素替代物的應(yīng)用與開發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ),同時(shí)也為新型抗菌肽的開發(fā)與利用提供新的資源和途徑,使抗菌肽在食品、醫(yī)藥、化妝品等諸多領(lǐng)域都能夠有著可觀的應(yīng)用前景和研究?jī)r(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q946

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7 彭文t，

本文編號(hào)：1296934