本文關鍵詞：結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Rv0315三維結(jié)構(gòu)的解析及生物學功能的研究

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【摘要】：結(jié)核病是一種古老的細菌性疫病,是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)感染或者長期潛伏引起的嚴重危害人類和動物健康的傳染病。在世界范圍內(nèi),大約有二十億人潛伏感染了結(jié)核分枝桿菌,造成了每年約兩百萬人的死亡,它仍然是引起發(fā)病率和死亡率的主要病原。2012年Eui-H ong Byun等人將結(jié)核分枝桿菌的分泌蛋白通過液相色譜法分離并收集,并用不同管數(shù)的蛋白處理DC細胞,發(fā)現(xiàn)Rv0315蛋白可以通過激活NF-κB信號通路以及MAPK信號通路顯著性的誘導DC細胞的成熟,是一個新發(fā)現(xiàn)的潛在的免疫性抗原。為了解決結(jié)核分枝桿菌的耐藥性以及市場上現(xiàn)有疫苗效果的局限性這一現(xiàn)狀,我們需要探究新的結(jié)核疫苗候選分子的一些特性,因此開展了關于Rv0315的結(jié)構(gòu)和功能的研究。利用結(jié)構(gòu)生物學平臺我們首次解析了Rv0315的三維結(jié)構(gòu),并對它的功能以及發(fā)揮功能的機制進行了研究和探討。具體研究內(nèi)容如下:Rv0315屬于β-1,3葡聚糖酶家族。β-1,3葡聚糖酶屬于糖苷水解酶16家族,他們具有序列和結(jié)構(gòu)的同源性。基于這個共性,我們首先從NCBI數(shù)據(jù)庫中將目前已知結(jié)構(gòu)和功能的所有β-1,3葡聚糖酶的氨基酸序列導出,并將它們與Rv0315一起做了氨基酸的多序列比對,Rv0315在序列上展示出與β-1,3葡聚糖酶較高的序列同源性,保守的兩個谷氨酸催化位點以及鈣離子結(jié)合位點都是存在的。通過序列比對我們發(fā)現(xiàn)Rv0315屬于β-1,3葡聚糖酶家族。GH16家族的β-1,3葡聚糖酶還有一個特點就是結(jié)構(gòu)的同源性也很高,基于β-1,3葡聚糖酶家族的這個共性,我們首先構(gòu)建了H37Rv株Rv0315全長的表達質(zhì)粒pET42b-Rv0315,利用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得了可溶性表達的蛋白。通過實驗室已有的晶體篩選試劑盒篩選和優(yōu)化得到一個分辨率達1.7?的晶體,收集數(shù)據(jù)并通過分子置換的方法解析了Rv0315的結(jié)構(gòu)。由Rv0315的結(jié)構(gòu)可以看出它符合β-1,3葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)特征,包括16個β折疊形成的兩個β片層,β片層彎曲形成一個凹面,是一個催化活性中心;兩個較短的α螺旋和一個鈣離子。通過以上從序列和結(jié)構(gòu)上分析,我們發(fā)現(xiàn)rv0315是一個β-1,3葡聚糖酶。rv0315是一個沒有活性的β-1,3葡聚糖酶。細菌產(chǎn)生的β-1,3葡聚糖酶都屬于糖苷水解酶16家族,所有的β-1,3葡聚糖酶都可以水解β-1,3糖苷鍵的糖,例如昆布多糖,少部分也可以水解β-1,3-1,4糖苷鍵的糖,例如大麥來源的β葡聚糖。rv0315是一個β-1,3葡聚糖酶,所以我們通過dns實驗測定了其對昆布多糖以及大麥來源的β葡聚糖的水解活性。奇怪的是,rv0315既不能降解昆布多糖,同時對大麥來源的β葡聚糖也沒有可檢測到的水解活性。從以上結(jié)果可知,rv0315是一個沒有活性的β-1,3葡聚糖酶。我們將目前已知結(jié)構(gòu)和功能的gh16家族的β-1,3葡聚糖酶做了進化樹分析,結(jié)果顯示rv0315與海魚分枝桿菌的β-1,3葡聚糖酶(pdb號4pq9)形成了一個獨立的進化分支。4pq9的結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析,功能沒有相關的報道,相關文章對該基因的標注是β-1,3葡聚糖酶。我們合成了4pq9基因并成功獲得了可溶性的蛋白,我們利用同樣的方法檢測了4pq9的水解活性,結(jié)果表明4pq9也是一個沒有活性的β-1,3葡聚糖酶。我們發(fā)現(xiàn)了gh16家族β-1,3葡聚糖酶中一個獨立的進化分支,這個分支是由兩個沒有活性的β-1,3葡聚糖酶組成。rv0315沒有多糖水解活性的分子機制。我們通過比對rv0315與海洋細菌的β-1,3葡聚糖酶(pdb號4bow)的結(jié)構(gòu)來解釋rv0315沒有水解活性的機制。4bow對昆布多糖有很高的催化活性,同時也可以水解mlg。mlg是一種β-1,3-1,4葡聚糖,跟大麥來源的β葡聚糖相似。通過結(jié)構(gòu)比較我們發(fā)現(xiàn),4bow中-2位以及-3位跟多糖結(jié)合相關的氨基酸殘基在gh16家族β-1,3葡聚糖酶中都是保守的,但rv0315中都是缺失或者突變的,而-1位的跟葡萄糖單位結(jié)合的氨基酸在rv0315中也是保守的。所以,目前所知道的rv0315唯一可以結(jié)合的分子就是乙二醇。乙二醇分子是在rv0315結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的,結(jié)合的位置跟-1位的葡萄糖單位所在的位置類似。從整體結(jié)構(gòu)比較可以看出,rv0315的催化裂開口很大。由結(jié)構(gòu)比較的結(jié)果可以看出rv0315由于結(jié)合底物相關的氨基酸的缺失或者突變使其催化裂的開口較大,導致rv0315不能結(jié)合多糖進而不能水解多糖。我們通過itc實驗驗證了rv0315確實不能結(jié)合昆布多糖,而4bow-e269s可以結(jié)合多糖并呈現(xiàn)很好的擬合曲線。一個昆布多糖分子可以結(jié)合兩個4bow-e269s分子。Rv0315的結(jié)構(gòu)與其發(fā)揮免疫學功能的關系。Rv0315雖然是一個沒有活性的β-1,3葡聚糖酶,但其兩個擔當催化作用的谷氨酸位點還是存在的。Rv0315可能在長期進化過程中失去水解多糖的功能進而參與發(fā)揮免疫學功能。因為Rv0315開口比較大,當結(jié)核分枝桿菌入侵機體時可能更容易暴露而受到免疫相關分子的攻擊,因此參與適應性免疫應答。為了驗證我們的推測,我們通過熒光素酶報告實驗來檢測Rv0315以及突變體Rv0315E176S、Rv0315D289A對NF-κB信號通路的激活情況,Rv0315以及Rv0315D289A可以激活NF-κB信號通路并且呈劑量依賴性。而催化活性位點176位的突變體則不能激活NF-κB信號通路。此外,我們還用不同濃度的Rv0315以及突變體蛋白處理DC細胞,檢測它們誘導DC細胞成熟的能力,結(jié)果跟熒光素酶報告實驗的結(jié)果相同,Rv0315和Rv0315D289A可以誘導DC細胞成熟,而Rv0315E176S則不能誘導DC細胞的成熟。綜上所述,Rv0315可能是從GH16家族的β-1,3葡聚糖酶進化而來,這個沒有活性的成員為GH16家族β-1,3葡聚糖酶提供了新的認識。我們研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌中沒有活性的β-1,3葡聚糖酶可以驅(qū)化Th1細胞免疫應答,176位谷氨酸是其發(fā)揮免疫學功能的關鍵氨基酸,這為結(jié)核疫苗的開發(fā)提供了新的依據(jù)。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378.911;S852.618

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本文編號：1295974