本文關(guān)鍵詞：玉米冷響應(yīng)相關(guān)基因的克隆、功能鑒定及定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究

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【摘要】：非生物脅迫,如低溫、干旱和鹽脅迫等嚴(yán)重限制了植物的生長(zhǎng)與產(chǎn)量。其中低溫影響植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、空間分布和作物產(chǎn)量。許多重要的糧食作物,如玉米、水稻、大豆、番茄等,對(duì)冷比較敏感,冷適應(yīng)性差。中國(guó)東北地區(qū)是玉米的主要產(chǎn)區(qū),由于地理?xiàng)l件等因素,春季經(jīng)常遭受冷害的侵襲,導(dǎo)致玉米大面積減產(chǎn)。隨著玉米需求量的不斷擴(kuò)大,如何提高玉米的綜合產(chǎn)量成為當(dāng)務(wù)之急。傳統(tǒng)育種和分子標(biāo)記輔助的有效結(jié)合能夠選育出抗逆和廣泛適應(yīng)性的玉米新品種。為了挖掘參與低溫響應(yīng)的潛在基因和揭示逆境響應(yīng)機(jī)制,本研究以玉米抗冷自交系W9816為實(shí)驗(yàn)材料,選取三葉期的葉片和根部組織,采用c DNA-AFLP(c DNA amplified fragments length polymorphism)的方法,利用174對(duì)引物組合,比較低溫處理前后基因的差異表達(dá)情況。根據(jù)c DNA-AFLP分析,葉片中發(fā)現(xiàn)6829條TDFs(Transcript-derived fragments),根部6955條TDFs。每對(duì)引物組合30-50個(gè)AFLP擴(kuò)增帶,其大小介于70-600 bp之間。盡管大多數(shù)條帶在冷脅迫后沒有發(fā)生明顯變化,但在葉片中仍然檢測(cè)到620個(gè)差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes,DEGs),根部531個(gè)DEGs。這些差異表達(dá)基因顯示出不同的表達(dá)模式。其中,僅61個(gè)上調(diào)的DEGs和32個(gè)下調(diào)的DEGs在兩種組織中同時(shí)具有一致的表達(dá)趨勢(shì)。大多數(shù)DEGs冷脅迫后在兩種組織中體現(xiàn)出不同的表達(dá)趨勢(shì)。通過NCBI BLASTX和Maize GDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析,根據(jù)其功能將差異表達(dá)基因分為5類:信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(10,15%)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控(9,13%)、翻譯和翻譯后修飾(10,15%)、細(xì)胞代謝與組織(24,36%),6個(gè)DEGs推測(cè)為編碼蛋白(9%),8個(gè)DEGs在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有匹配(12%)。利用q RT-PCR的方法驗(yàn)證了16個(gè)玉米抗冷相關(guān)的候選基因。Sec14-like蛋白參與必要的生物學(xué)過程,例如磷脂代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜運(yùn)輸以及逆境響應(yīng)。本研究采用RACE(Rapid amplification of c DNA ends)PCR的方法首次成功克隆了一個(gè)磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白Zm SEC14p(accession no.KT932998)。Zm SEC14p基因全長(zhǎng)包括一個(gè)完整的開放閱讀框,推測(cè)編碼295個(gè)氨基酸。染色體定位表明Zm SEC14p基因定位于玉米基因組1號(hào)染色體上,橫跨3420 bp,包括5個(gè)外顯子。多重序列比對(duì)表明玉米Zm SEC14p與高粱Sb SEC14p氨基酸同源性最高;進(jìn)化樹分析表明Zm SEC14p屬于UCSH的一個(gè)成員,僅僅包含一個(gè)SEC14 domain。I-TASSER結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明Zm SEC14p蛋白包括10個(gè)α螺旋、5個(gè)β折疊、3個(gè)310螺旋,其中,7個(gè)α螺旋、5個(gè)β折疊以及2個(gè)310螺旋可形成磷脂結(jié)合口袋。基因表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn),Zm SEC14p基因轉(zhuǎn)錄受低溫、鹽以及ABA誘導(dǎo)表達(dá);組織特異性分析表明Zm SEC14p在玉米葉片中表達(dá)最高。亞細(xì)胞定位表明Zm SEC14p蛋白主要定位于細(xì)胞核。對(duì)過表達(dá)Zm SEC14p轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期抗逆表型鑒定發(fā)現(xiàn):在種子萌發(fā)階段,轉(zhuǎn)基因植株能夠顯著降低對(duì)低溫的敏感性,提高了對(duì)Na Cl和ABA的敏感性;在苗期,轉(zhuǎn)基因植株在低溫脅迫下具有更快的初生根生長(zhǎng)速率;對(duì)生殖生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期Zm SEC14p轉(zhuǎn)基因株系的抗冷表型鑒定結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因株系較野生型株系存活率提高了約38%�；钚匝踅M織定位以及抗氧化酶(SOD、POD)活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明,低溫脅迫后,相比于野生型株系,轉(zhuǎn)基因株系能夠顯著提高POD和SOD抗氧化酶的活性,酶活的提高與Zm SEC14p調(diào)控抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。脯氨酸含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明,低溫處理48 h后,Zm SEC14p轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量分別是野生型的1.35和1.61倍。低溫脅迫下,轉(zhuǎn)基因擬南芥中一些逆境脅迫應(yīng)答基因(如CBF3、COR6.6、RD29B)的表達(dá)量較野生型顯著上調(diào)。上調(diào)表達(dá)的逆境響應(yīng)基因推測(cè)與Zm SEC14p調(diào)節(jié)磷脂酶C(PLC)基因的表達(dá)與酶的活性相關(guān)。利用i TRAQ(Isobaric tags for relative and absolute quantification)定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較低溫處理前后玉米葉片蛋白質(zhì)豐度變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低溫脅迫共鑒定到173個(gè)差異豐度蛋白(Differential abundance protein species,DAPS)。這些DAPS被分為以下功能類別:碳和能量代謝(38,22.0%)、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)(13,7.51%)、翻譯、核糖體的結(jié)構(gòu)與合成(15,8.67%)、翻譯后修飾、蛋白折疊與分子伴侶(14,8.09%)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(13,7.51%)、逆境響應(yīng)(12,6.94%)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(9,5.20%)、脂類代謝(5,2.90%)、次生代謝的生物合成(6,3.47%)、無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(2,1.16%)、復(fù)制、重組和修復(fù)(2,1.16%)、其它生物學(xué)過程(22,12.71%)和未知生物學(xué)過程(22,12.71%)。生物信息分析表明159個(gè)DAPS被注釋到38個(gè)GO(Gene Ontology)功能組;108個(gè)DAPS被分為20個(gè)COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)類別;99個(gè)DAPS參與60個(gè)KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝通路�？寡趸瘜�(shí)驗(yàn)證明了i TRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。轉(zhuǎn)錄譜與蛋白譜的關(guān)聯(lián)分析表明低溫脅迫玉米葉片中存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)和翻譯后修飾等過程�；诘鞍椎墓δ苄苑治�,玉米苗期低溫脅迫響應(yīng)的適應(yīng)性機(jī)制可能包括緩解由于葉綠體膜能量過剩引起的光損傷;通過糖酵解產(chǎn)生更多的能量;增加逆境響應(yīng)蛋白的豐度;提高清除ROS的整體能力。轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)和翻譯后修飾在玉米低溫脅迫響應(yīng)中也扮演重要的角色。目前還未見到有關(guān)玉米苗期低溫脅迫蛋白質(zhì)豐度變化的研究報(bào)道。綜合以上研究表明,Zm SEC14p作為逆境脅迫響應(yīng)基因在逆境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起正向調(diào)控作用,同時(shí),本研究從轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平進(jìn)行研究,增加了對(duì)玉米冷響應(yīng)機(jī)制的理解,為今后通過基因工程改良玉米抗逆性提供了重要的候選基因。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S513;Q943.2
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本文編號(hào)：1292402