本文關(guān)鍵詞：紅藻光合作用藻膽體—類囊體膜的超分子結(jié)構(gòu)及其對缺氮的響應(yīng)

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【摘要】：光合作用是地球上最重要的生化過程,由光合膜內(nèi)的一系列色素蛋白相互協(xié)作完成。真核紅藻是真核光合生物演化過程中非常重要的環(huán)節(jié),其光合系統(tǒng)具有較多和原核藍(lán)藻相似的特點,是具有重要研究意義的光合生物門類。藍(lán)藻和紅藻光合膜的結(jié)構(gòu)比較特殊,類囊體膜表面覆蓋了一層外置的光合天線——藻膽體(phycobilisome,PBS)。藻膽體是由藻膽蛋白(phycobiliproteins,PBPs)和連接蛋白高度有序裝配而成的超分子復(fù)合物,主要有四種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)類型:半盤狀、半橢球狀、束狀和塊狀。在自然環(huán)境中,包括藍(lán)藻和紅藻在內(nèi)的光合生物進(jìn)化出了多種響應(yīng)機(jī)制以適應(yīng)不利的生存環(huán)境。例如,在缺氮環(huán)境中,非固氮藍(lán)藻及紅藻的藻膽體會被降解,為藻體生存提供氮源。盡管氮元素是限制光合生物生長的關(guān)鍵性決定因素之一,但目前依然缺乏對氮脅迫下植物和藻類光合膜超分子結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的直接觀察。而原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)技術(shù)是一種在近生理條件下研究天然光合膜超分子結(jié)構(gòu)的強(qiáng)大有效的方法。紫色細(xì)菌及高等植物的光合膜已經(jīng)利用AFM進(jìn)行了詳細(xì)的研究,但有關(guān)藍(lán)藻和紅藻光合膜的AFM研究卻非常少。半盤狀藻膽體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)明確,但紅藻的半橢球形藻膽體精確結(jié)構(gòu)依然不清楚。目前對紅藻藻膽體-類囊體膜的超分子結(jié)構(gòu)研究僅局限于原紅藻綱單細(xì)胞紅藻紫球藻Porphyridium cruentum 對不同進(jìn)化地位的紅藻藻膽體的形貌結(jié)構(gòu)及其在類囊體膜上排布模式的多樣性缺乏研究。光合膜超分子結(jié)構(gòu)與光合性能密切相關(guān),而葉綠素(chlorophyll,Ch1)熒光動力學(xué)與放氧生物的光合作用密切相關(guān),這項技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于紅藻光合作用的研究中,探究了其對不同生長條件的適應(yīng)機(jī)制,比如輻照度、溫度、重金屬、鹽度等。然而,有關(guān)營養(yǎng)限制后紅藻光合性能的研究相對缺乏。本論文圍繞紅藻光合膜及藻膽體的結(jié)構(gòu)、性能及環(huán)境調(diào)控,通過膜生物化學(xué)、AFM、透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)以及光譜學(xué)等手段進(jìn)行了多方面的研究,取得了如下研究結(jié)果:一.單細(xì)胞紅藻紫球藻藻膽體-類囊體膜超分子結(jié)構(gòu)研究為了研究紅藻藻膽體-類囊體膜的表面超分子形貌,我們通過比較溫和的方法提取了紫球藻的完整藻膽體-類囊體膜囊,利用吸收光譜和熒光光譜檢測了其結(jié)構(gòu)和功能的完整性,利用AFM探究了藻膽體-類囊體膜及其上藻膽體的超分子結(jié)構(gòu)。同時我們分離了完整的藻膽體,電泳檢測了其組分。我們的研究發(fā)現(xiàn):類囊體膜充滿了整個藻體且大部分區(qū)域平行排布;提取的藻膽體-類囊體膜的結(jié)構(gòu)和功能是完整的;藻膽體-類囊體膜囊絕大多數(shù)都近似圓形,直徑范圍為0.5-8.5μm,膜囊的厚度范圍為45-65 nm;有的膜囊上存在折疊,說明部分膜囊在藻體中的空間形態(tài)并非處于同一平面;在一些膜囊上也會觀察到缺口,說明類囊體膜囊之間可能存在連通,以方便物質(zhì)的傳輸,缺口也有可能是膜囊內(nèi)容物流出時導(dǎo)致的破損;藻膽體在類囊體膜表面緊密排布,大部是隨機(jī)無序排布的;藻膽體為半橢球形,長約58±4nm,寬約40±3nm,高約27±2nm(n300),在類囊體膜上的密度為(384±17)/μm-2(n10)。我們的實驗結(jié)果表明,AFM是研究天然狀態(tài)下類囊體膜結(jié)構(gòu)及藻膽體結(jié)構(gòu)的強(qiáng)有力手段,相應(yīng)的結(jié)果為我們對紅藻類囊體膜及藻膽體天然結(jié)構(gòu)的理解提供了重要的線索。二.紫球藻藻膽體-類囊體膜超分子結(jié)構(gòu)缺氮調(diào)控研究為了揭示紅藻光合膜超分子結(jié)構(gòu)的缺氮調(diào)控機(jī)制,我們利用AFM并輔以其它技術(shù)研究了缺氮過程中紫球藻類囊體膜超分子結(jié)構(gòu)的變化。我們對藻體的生長及Ch1含量進(jìn)行了測定,檢測了藻體及分離的類囊體膜、藻膽體光譜的變化,以表征缺氮后藻體的生理生化狀態(tài),結(jié)果顯示缺氮過程中藻細(xì)胞數(shù)量增加,但其增殖速率要小于對照;藻體Ch1的含量逐漸降低,說明光系統(tǒng)受到了缺氮的影響;光譜變化表明藻膽蛋白的含量逐漸減少到了相當(dāng)?shù)偷乃?說明藻體中大部分藻膽體被降解了,藻體顏色的變化也證明了這一點。為了研究缺氮后藻體內(nèi)類囊體膜的整體變化,我們利用TEM觀察了藻體的超薄切片,藻體內(nèi)類囊體膜明顯減少,失去了緊密平行排布的結(jié)構(gòu)特點。我們對分離的藻膽體進(jìn)行了電泳分析,檢測了缺氮后藻膽體組分的變化。利用AFM掃描了缺氮后的藻膽體-類囊體膜,以觀察缺氮后藻膽體-類囊體膜及藻膽體超分子結(jié)構(gòu)的變化,結(jié)果顯示類囊體膜囊仍然保持了圓形形態(tài),其直徑隨缺氮時間延長有輕微的增加;藻膽體在膜上的密度逐漸降低,缺氮20天時,藻膽體的密度減少到了僅51/μm-2;藻膽體逐漸變小,缺氮20天后藻膽體的長寬高分別減少了大約15%、23%、48%,但其仍保留了半球狀的形態(tài);在類囊體膜上出現(xiàn)了孔洞,孔洞的分布遍及整個膜片,隨著缺氮加劇,孔洞變多變大。為了確定缺氮類囊體膜上缺失的復(fù)合物為藻膽體,并對膜上的孔洞問題進(jìn)行深入研究,我們進(jìn)一步對無藻膽體膜進(jìn)行掃描觀察。最后我們對嚴(yán)重缺氮的紫球藻進(jìn)行了補(bǔ)氮恢復(fù)實驗,以確證我們的實驗結(jié)果。補(bǔ)氮后,培養(yǎng)液顏色由黃綠色變?yōu)樯罴t色,光譜得到恢復(fù),類囊體膜上藻膽體數(shù)量增多,這些結(jié)果表明重新添加氮源后藻膽體得到了恢復(fù)。AFM獲得的結(jié)果有助于我們更好地理解氮脅迫下類囊體膜的變化以及藻膽體的降解機(jī)制。我們的工作第一次直接觀察了光合生物為應(yīng)對氮脅迫而引起的類囊體膜超分子結(jié)構(gòu)的變化。三.半橢球形藻膽體高分辨率結(jié)構(gòu)研究利用AFM天然直觀的優(yōu)勢,我們對位于紫球藻類囊體膜上的藻膽體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。首先我們對掃描探針、掃描參數(shù)以及制片方法進(jìn)行了改進(jìn)優(yōu)化。而后對類囊體膜上擁擠狀態(tài)下的規(guī)則排布和不規(guī)則排布藻膽體分別進(jìn)行了 AFM掃描,擁擠排布的藻膽體可按長軸方向分為兩部分,在中間部位有一道明顯的溝回,兩側(cè)可進(jìn)一步觀察到排布相似的圓形溝回,說明藻膽體很可能是長軸對稱結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步提高分辨率,我們通過缺氮、低鹽透析和缺氮恢復(fù)三種方法使類囊體膜上藻膽體稀疏,以觀察到更多結(jié)構(gòu)信息。缺氮后類囊體膜上藻膽體數(shù)量會減少,基于這一自然反應(yīng),對缺氮20天類囊體膜上的藻膽體高分辨率結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。我們可以觀察到比擁擠狀態(tài)下的藻膽體更多的細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu),說明稀疏狀態(tài)下的藻膽體更有利于高分辨觀察。在低鹽緩沖液中藻膽體會從膜上解離,同時自身也會發(fā)生解離,因此我們?nèi)藶榻档土嗽迥戵w在膜上的密度,破壞了藻膽體結(jié)構(gòu)的完整性。我們觀察到了更多的藻膽體內(nèi)部結(jié)構(gòu),為我們提供了更多有關(guān)半橢球形藻膽體的結(jié)構(gòu)信息。缺氮恢復(fù)過程中類囊體膜上會有新的藻膽體合成,膜上會存在不同合成狀態(tài)的藻膽體,我們通過對缺氮恢復(fù)中藻膽體的高分辨形貌觀察初步研究了其合成過程。結(jié)果顯示藻膽體的大小形態(tài)不均一,尺寸較大的藻膽體結(jié)構(gòu)較為完整,尺寸較小的藻膽體上的溝回較少,說明其結(jié)構(gòu)相對較為簡單,其上球狀凸起較少,說明桿的數(shù)量少,同樣可以觀察到中間明顯的溝回,說明藻膽體可能是對稱合成的。我們推測半橢球形藻膽體首先合成核心結(jié)構(gòu),然后按長軸對稱逐漸合成桿,桿的數(shù)量及長度逐漸組裝成正常水平。綜上,稀疏狀態(tài)下的AFM高分辨率成像從另一角度為我們提供了更多有關(guān)半橢球形藻膽體的結(jié)構(gòu)信息。四.利用葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)研究紫球藻缺氮后的光合性能氮是植物和藻類生存所需的最重要營養(yǎng)元素之一,而藻類的光合性能與氮源的豐度有關(guān)。Ch1熒光動力學(xué)與光合生物光合作用密切相關(guān)。本論文中,我們利用多色脈沖振幅調(diào)制(multi-color-pulse amplitude modulation,multi-color-PAM)熒光計檢測了缺氮紫球藻的活體Ch1熒光動力學(xué),包括慢速Ch1 a熒光動力學(xué)、快速光響應(yīng)曲線(rapid light curve,RLC)和快速Ch1 a熒光動力學(xué),分析了缺氮對光合性能的影響。缺氮后,光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ,PSⅡ)的光化學(xué)效率以及反應(yīng)中心(reactioncenter,RC)的活性下降,PS Ⅱ發(fā)生光抑制;光合裝置受損,光能轉(zhuǎn)換效率下降,但電子傳遞能力沒有下降(ETo/TRo,REo/ETo);PSⅡ供體端的水裂解系統(tǒng)受缺氮影響嚴(yán)重,導(dǎo)致了放氧復(fù)合物(oxygen-evolving complex,OEC)的失活,正向的K-band有力地支持了這一點;傳遞到PSⅡ的光能減少導(dǎo)致了更大比例的能量用于光化學(xué)反應(yīng),熱耗散的比例下降,如qP和qN所示;RLC顯示缺氮藻體對高光強(qiáng)的耐受力和抵抗力下降;VOI顯示缺氮藻體到達(dá)P相的時間增加,末端電子受體庫增大;缺氮后活性反應(yīng)中心的密度降低。我們的研究顯示,氮脅迫后紫球藻的光合裝置受損,光合性能下降。五.多細(xì)胞紅藻條斑紫菜和多管藻藻膽體-類囊體膜超分子結(jié)構(gòu)研究為了研究不同紅藻光合膜超分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系,我們以原始紅藻綱的多細(xì)胞大型紅藻條斑紫菜Porphyra yezoensis和真紅藻綱的多細(xì)胞大型紅藻多管藻Polysiphonia urceolata為研究材料,以紫球藻的光合膜研究為基礎(chǔ),對這兩種進(jìn)化地位較高的復(fù)雜紅藻藻膽體-類囊體膜超分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。我們利用吸收光譜和熒光光譜檢測了分離的藻膽體-類囊體膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性,利用AFM對藻膽體-類囊體膜及其上藻膽體的超分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn),提取的藻膽體-類囊體膜的結(jié)構(gòu)和功能是完整的,分離的條斑紫菜藻膽體-類囊體膜形貌主要有兩種類型:一種是不規(guī)則膜片,膜上孔洞較多,平整性差,大小約1-10 μm,厚度約35-75 nm;一種是同紫球藻類似的圓形膜片,直徑約1 μm,膜片厚約35-65 nm,膜上孔洞少,表面比較平整均一。藻膽體排布緊密無序,為半橢球形的,邊界不明顯,長約52 nm,寬約40 nm,高約18 nm。分離的多管藻藻膽體-類囊體膜整體形貌不規(guī)則,膜上孔洞較多,平整性差,膜片厚約35-60 nm。藻膽體排布緊密無序,膜上存在半橢球形藻膽體,長約49 nm,寬約34 nm,高約23 nm,同時也存在一些形狀不規(guī)則或者是磚塊狀排列成行的結(jié)構(gòu),我們推測膜上除了半橢球形藻膽體外還可能存在其它類型的藻膽體。我們第一次利用AFM直接觀察到了大型紅藻的藻膽體-類囊體膜的天然形貌,深化了對紅藻捕光復(fù)合物(light-harvesting complexes,LHC)的研究,對紅藻光合膜超分子結(jié)構(gòu)以及光合體系的進(jìn)化有更加深入的理解。本論文利用AFM、TEM、PAM分析技術(shù)結(jié)合光譜學(xué)以及生化實驗等手段,對紅藻光合膜超分子結(jié)構(gòu)及缺氮調(diào)控、半橢球形藻膽體超分子結(jié)構(gòu)、紅藻氮脅迫下光合性能的調(diào)控進(jìn)行了研究。從全新的角度直觀地揭示了缺氮后紅藻類囊體膜超分子結(jié)構(gòu)的調(diào)控機(jī)制。加深了對半橢球形藻膽體的三維超分子結(jié)構(gòu)的了解。提供了有關(guān)紅藻光合膜超分子結(jié)構(gòu)以及光合體系進(jìn)化的相關(guān)信息。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q945
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本文編號：1291043