本文關(guān)鍵詞：去甲基化蛋白酶ALKBH5與轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白NaID結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的研究

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【摘要】：蛋白質(zhì)是細(xì)胞的重要組成分子,與生物體中各種生命活動(dòng)緊密相關(guān)。由于蛋白質(zhì)的氨基酸組成和空間結(jié)構(gòu)千變?nèi)f化,使得蛋白質(zhì)具有多種多樣的性質(zhì)與功能。研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),并了解其相關(guān)的生物活性,對(duì)于深入了解生命體中的各種生理活動(dòng)與生命現(xiàn)象具有重要意義。本論文中,我們利用蛋白晶體學(xué)成功得到了斑馬魚(yú)中的N6-甲基腺嘌呤(m6A)去甲基化蛋白酶ALKBH5和綠膿桿菌中MexAB-OprM多藥耐藥外排泵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白NalD的晶體結(jié)構(gòu),并依據(jù)這兩個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)它們的生物活性和功能進(jìn)行了一系列的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)。此外,我們還利用蛋白質(zhì)工程對(duì)NalD蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,使改構(gòu)的蛋白能夠識(shí)別TetR蛋白結(jié)合的DNA序列。ALKBH5蛋白屬于二價(jià)鐵/α-酮戊二酸鹽依賴(lài)型雙加氧酶AlkB蛋白家族。它能催化單鏈RNA中的m6A發(fā)生去甲基化反應(yīng),生成腺嘌呤。我們成功獲得了斑馬魚(yú)ALKBH5蛋白晶體,并解析得到其蛋白結(jié)構(gòu)。通過(guò)與另一個(gè)m6A去甲基化蛋白酶FTO的結(jié)構(gòu)比對(duì),我們發(fā)現(xiàn)ALKBH5蛋白中的氨基酸Lysl00和Pro175可能參與了m6A去甲基化反應(yīng)。這一結(jié)論通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)(MALDI-TOF-MS)得到進(jìn)一步確認(rèn)。此外,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)ALKBH5蛋白催化的m6A去甲基化過(guò)程與FTO蛋白的催化過(guò)程不同：FTO蛋白在催化m6A去甲基化的反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生了中間產(chǎn)物N6-羥甲基腺嘌呤(hm6A)和N6-醛基腺嘌呤(frn6A),而ALKBH5催化的反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)中間產(chǎn)物。這些研究對(duì)于我們理解AlkB家族蛋白的底物選擇性以及進(jìn)一步研究m6A去甲基化的反應(yīng)機(jī)制具有重要意義。MexAB-OprM多藥耐藥外排泵是綠膿桿菌中一個(gè)重要的藥物外排泵,對(duì)綠膿桿菌的高抗藥性起到了顯著作用。NalD蛋白是MexAB-OprM多藥耐藥外排泵的第二個(gè)調(diào)控蛋白,但是其調(diào)控機(jī)制還不清楚。為了進(jìn)一步了解NalD蛋白的性質(zhì),我們對(duì)NalD蛋白進(jìn)行表達(dá)與純化,并開(kāi)展了一系列的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)。Thermal shift、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)、等溫滴定量熱(ITC)以及體內(nèi)熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明新生霉素能夠誘導(dǎo)NalD蛋白與MexAB-OprM多藥耐藥外排泵的啟動(dòng)子DNA解離,從而激活外排泵的表達(dá)。此外,我們還成功解析了NalD蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。通過(guò)與惡臭假單胞桿菌中的TtgR蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì),并進(jìn)行EMSA、ITC、突變菌株平板實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)氨基酸Asn129和His167參與了NalD蛋白與新生霉素之間的相互作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了MexAB-OprM多藥耐藥外排泵調(diào)控體系的多樣性,并為進(jìn)一步了解細(xì)菌的抗藥性提供了研究基礎(chǔ)。NalD蛋白與大腸桿菌中的四環(huán)素抗性調(diào)控蛋白TetR都屬于TetR轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白家族。結(jié)構(gòu)比對(duì)的結(jié)果表明,NalD蛋白與TetR蛋白具有很高的相似性,尤其在DNA結(jié)合區(qū)域。為了改造NalD蛋白使其能夠識(shí)別TetR蛋白的DNA序列,我們嘗試?yán)玫鞍踪|(zhì)工程技術(shù)將NalD蛋白的DNA結(jié)合區(qū)域替換成TetR蛋白中的對(duì)應(yīng)區(qū)域。改構(gòu)蛋白在大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中與分子伴侶質(zhì)粒(Chaperone plasmid)共表達(dá),并用FPLC系統(tǒng)進(jìn)行純化。EMSA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)改構(gòu)蛋白仍然具有生物活性,而且能夠特異性識(shí)別TetR蛋白的DNA結(jié)合序列。這表明根據(jù)已知蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)其功能進(jìn)行改造是成功的。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q51

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