本文關(guān)鍵詞：核質(zhì)轉(zhuǎn)運受體AtImportin α作為轉(zhuǎn)錄抑制因子調(diào)控茉莉酸信號的分子機理

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【摘要】：在真核細(xì)胞中,雙層的核膜系統(tǒng)將細(xì)胞遺傳信息的存貯、轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)的翻譯以及眾多細(xì)胞的代謝過程分隔開來。而細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間的信息交流在細(xì)胞生命活動的調(diào)控過程中至關(guān)重要。鑲嵌在核膜上的核孔復(fù)合體為兩者之間的交流提供了一條雙向的、選擇透性的分子通道。金屬離子、代謝產(chǎn)物以及小分子量的中性蛋白以自由擴散的形式進出細(xì)胞核,而分子量超過40KDa的大分子物質(zhì)則需要與核質(zhì)轉(zhuǎn)運受體相結(jié)合以主動擴散的形式通過核孔進出細(xì)胞核。大多數(shù)的主動轉(zhuǎn)運過程主要由兩類在進化上相對保守的轉(zhuǎn)運受體家族Importin(IMP)α和IMPβ所介導(dǎo)。在經(jīng)典的核輸入路徑中,IMPα負(fù)責(zé)識別帶有核定位信號的底物蛋白,然后與IMPβ結(jié)合形成三聚體復(fù)合物,進而啟動轉(zhuǎn)運過程。IMPα作為核質(zhì)轉(zhuǎn)運的接頭蛋白,它的功能在動物和真菌中已經(jīng)有了大量的研究和報道,但在植物中的進展卻非常緩慢。到目前為止,植物IMPα直接參與的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及發(fā)育過程報道很少。本研究發(fā)現(xiàn)擬南芥的IMPα1、IMPα2和IMPα3可以不依賴自身的轉(zhuǎn)運功能,而是作為轉(zhuǎn)錄抑制因子參與植物激素茉莉酸(jasmonate,JA)信號的調(diào)控過程。主要的研究結(jié)果如下:(1)IMPα1、IMPα2和IMPα3冗余地參與到負(fù)調(diào)茉莉酸誘導(dǎo)的花青素合成過程。通過對impα1、impα2和impα3各種單突變體,雙突變體以及三突變的表型鑒定,我們發(fā)現(xiàn)與野生型相比,茉莉酸誘導(dǎo)的花青素積累量在impα1impα2impα3三突變體中明顯增加,三突變體中受茉莉酸調(diào)控的與花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)量也明顯上調(diào)。而對于蔗糖和細(xì)胞分裂素(6-BA)誘導(dǎo)的花青素合成過程在三突變體中卻沒有受到影響,表明IMPα專一地調(diào)控茉莉酸誘導(dǎo)的花青素積累。(2)impα1impα2impα3三突變體對茉莉酸介導(dǎo)的系統(tǒng)性機械損傷響應(yīng)顯著增強。對系統(tǒng)性機械損傷響應(yīng)過程的分析發(fā)現(xiàn),野生型的損傷響應(yīng)隨處理時間逐漸上升,在2小時左右達(dá)到峰值,然后逐漸降低到原始水平。三突變體在受到損傷后,響應(yīng)過程急劇上升并在1小時達(dá)到最高點,響應(yīng)強度和速度均要快于野生型。這些結(jié)果說明與野生型相比,三突變體對茉莉酸信號更加敏感。(3)IMPα1、IMPα2和IMPα3與MYC2直接互作。利用酵母雙雜交實驗,發(fā)現(xiàn)茉莉酸信號的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子MYC2可以與IMPα1、IMPα2和IMPα3互作,但不與IMPα9互作。與MYC2同源關(guān)系非常近的兩個轉(zhuǎn)錄因子MYC3和MYC4卻不能與IMPα1、IMPα2和IMPα3互作。另外,利用雙分子熒光互補試驗我們可以在細(xì)胞核中檢測到IMPα2與MYC22互作信號。而且MYC2在三突變體中仍然定位在細(xì)胞核內(nèi)。表明IMPα1、IMPα2和IMPα3與MYC2特異性互作。通過缺失分析,我們發(fā)現(xiàn)MYC2的兩個關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域JAZ Interacting Domain(JID)和b HLH motif均可以與IMPα1、IMPα2和IMPα3結(jié)合。通過免疫共沉淀,我們發(fā)現(xiàn)MYC2(MYC2NT1-364)可以與IMPα2在體內(nèi)互作,說明兩者的結(jié)合并不依賴MYC2的核定位信號(KRPKKRGRK433-441)。而且IMPα2的缺失片段IMPα296-535不能與空載體上的核定位信號互作,卻能與MYC2以及它的缺失突變互作,進一步證明了兩者的互作與IMPα的轉(zhuǎn)運功能無關(guān)。(4)IMPα1、IMPα2和IMPα3與WD-Repeat/b HLH/MYB復(fù)合體中的MYB型轉(zhuǎn)錄因子互作。利用酵母雙雜交實驗,我們發(fā)現(xiàn)IMPα1、IMPα2和IMPα3與MYB75以及MYB90有較強的互作活性。而且細(xì)胞核中也可以檢測到IMPα2-MYB75的互作信號。另外,缺失分析發(fā)現(xiàn)MYB75的N端和C端也都可以與IMPα1、IMPα2和IMPα3結(jié)合。而且,JAZ-MYB75的互作也被IMPα1、IMPα2和IMPα3所阻斷。這些結(jié)果進一步說明,IMPα1、IMPα2和IMPα3在與MYB75以及MYB90的互作中也不依賴于自身的轉(zhuǎn)運功能。(5)IMPα1、IMPα2和IMPα3抑制了MYC2和MYB75的轉(zhuǎn)錄活性。MYC2作為轉(zhuǎn)錄激活因子,可以顯著的激活靶啟動子PTAT1和PVSP1驅(qū)動的LUC基因的表達(dá),而MED25和抑制因子JAZ9可以分別增強或抑制MYC2的轉(zhuǎn)錄活性。IMPα1、IMPα2和IMPα3與MYC2共表達(dá),不同程度地抑制了MYC2的轉(zhuǎn)錄活性。進一步分析顯示,IMPα296-535同樣能抑制MYC2激活的PTAT1-LUC和PVSP1-LUC表達(dá)。MYB75作為花青素合成路徑中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄激活因子,共轉(zhuǎn)化實驗發(fā)現(xiàn)MYB75能強烈誘導(dǎo)靶啟動子PDFR-LUC的表達(dá),JAZ9抑制子可以有效地抑制MYB75的轉(zhuǎn)錄活性,而MED25對PDFR-LUC的表達(dá)沒有影響。與IMPα對MYC2轉(zhuǎn)錄活性的影響相似,IMPα1、IMPα2、IMPα3和IMPα296-535與MYB75的共表達(dá)同樣也有效地抑制了報告基因PDFR-LUC的表達(dá)。這些結(jié)果說明IMPα1、IMPα2和IMPα3與轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合抑制了它們的轉(zhuǎn)錄激活活性。(6)IMPα1、IMPα2和IMPα3抑制了轉(zhuǎn)錄因子MYC2和MYB75的DNA結(jié)合活性。通過酵母單雜交以及EMSA實驗我們發(fā)現(xiàn),IMPα1、IMPα2和IMPα3與MYC2和MYB75的結(jié)合分別抑制了MYC2與G-box元件的結(jié)合以及MYB75與PCE元件的結(jié)合。說明IMPα通過干擾轉(zhuǎn)錄因子與DNA元件的結(jié)合來影響MYC2和MYB75轉(zhuǎn)錄激活活性。(7)IMPα1、IMPα2和IMPα3干擾了MYC2-MED25和WD-Repeat/b HLH/MYB轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成。通過酵母三雜交和Pull-down實驗,我們發(fā)現(xiàn)輔激活因子MED25與MYC2的結(jié)合被IMPα1、IMPα2和IMPα3的結(jié)合完全阻斷。同樣,IMPα與MYB75的結(jié)合阻斷了TT8與MYB75的互作。這些結(jié)果說明IMPα1、IMPα2和IMPα3還可以通過影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的形成來抑制轉(zhuǎn)錄激活因子的活性。(8)IMPα1、IMPα2和IMPα3通過影響WD-Repeat/b HLH/MYB轉(zhuǎn)錄復(fù)合體來負(fù)調(diào)茉莉酸誘導(dǎo)的花青素合成過程。我們通過遺傳雜交的方式,獲得了ttg1-lmimpα1impα2impα3四突變體。結(jié)果顯示,在茉莉酸處理條件下,三突變中花青素含量增加的現(xiàn)象在四突變體中完全消失了。而且四突變體中茉莉酸誘導(dǎo)的花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)也與ttg1-lm一致。進一步說明三突變體對茉莉酸誘導(dǎo)花青素合成敏感的表型是通過WD-Repeat/b HLH/MYB轉(zhuǎn)錄復(fù)合體發(fā)揮作用的。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Karen S. Schumaker;;SAD2 in Arabidopsis Functions in Trichome Initiation through Mediating GL3 Function and Regulating GL1,TTG1 and GL2 Expression[J];Journal of Integrative Plant Biology;2008年07期

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本文編號：1290664