本文關(guān)鍵詞：RABV感染小鼠腦組織蛋白質(zhì)組學(xué)分析及自噬與RABV復(fù)制關(guān)系研究

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【摘要】：狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)感染引起的一種急性、高致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病。該病病原RABV屬于彈狀病毒科狂犬病病毒屬成員。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計,全球范圍內(nèi)每年約有59,000人死于狂犬病,且絕大多數(shù)病例發(fā)生在亞洲、非洲等發(fā)展中國家。目前,我國的狂犬病死亡病例僅次于印度,位列世界第二。對RABV的研究已逾百年,但關(guān)于其致病機理仍無明確定論。有關(guān)RABV與宿主細胞相互作用方面的了解還很有限,特別是RABV感染后引起的宿主蛋白質(zhì)整體變化水平及與之相關(guān)的失調(diào)的生物學(xué)功能整體研究進展較為緩慢。另外,目前對不同毒力的RABV致病性差異的機制研究主要集中在病毒蛋白本身序列或結(jié)構(gòu)上的差異,鮮有研究從宿主角度入手考慮與致病性差異有關(guān)的宿主相關(guān)因子的群體變化水平。近年來同位素標記相對和絕對定量(i TRAQ)聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)由于其高通量、高敏感性及定量準確性等特點被越來越多的應(yīng)用到病毒感染蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。聯(lián)合生物信息學(xué)的手段對差異表達蛋白進行系統(tǒng)的表達模式、功能聚類和參與的生物學(xué)通路及相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)進行分析,能夠快速篩選出與病毒感染或機體防御等功能密切相關(guān)的宿主反應(yīng)因子。因此,對RABV感染的小鼠腦組織蛋白表達譜進行定量分析對揭示RABV致病機理具有重要的指導(dǎo)意義。自噬是機體進化保守的一種胞內(nèi)降解途徑,能夠?qū)⑺ダ系募毎�、有害的蛋白聚集體、錯誤折疊蛋白等包裹至自噬體中,并通過與溶酶體融合實現(xiàn)內(nèi)容物的降解。自噬是細胞維持自身穩(wěn)態(tài)的重要生物學(xué)進程,亦是細胞應(yīng)對外界刺激和微生物感染的重要途徑,如營養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激、病毒感染等。多項研究表明病毒感染可以影響細胞自噬活性,如水皰性口炎病毒(VSV)、豬瘟病毒(CSFV)等的感染均可以誘導(dǎo)宿主細胞自噬。相反的,自噬也可以通過多種途徑影響病毒的感染,如自噬可以對水皰性口炎病毒的核酸進行加工并遞送至toll樣受體(TLRs)識別從而刺激干擾素(IFN)的產(chǎn)生實現(xiàn)自噬的抗病毒作用。然而,多種病毒已進化出逃避、對抗甚至利用自噬為自身感染提供便利的策略,如登革熱病毒可以利用自噬過程降解甘油三脂從而加速ATP的產(chǎn)生為自身復(fù)制提供能量。在我們的課題開始之初尚無RABV與自噬相互作用的報道,因此研究二者關(guān)系可為解析RABV致病機理提供重要依據(jù)。本研究利用i TRAQ LC-MS/MS定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對RABV標準攻擊毒株CVS-11感染后及RABV強、弱毒株感染后的小鼠腦組織蛋白表達譜進行比較分析,對篩選出來的差異表達蛋白進行生物信息學(xué)分析,挖掘出顯著相關(guān)的生物學(xué)通路——自噬,且在細胞水平上完成驗證,并對自噬對RABV感染的影響進行初步探索。本研究主要分為以下四個部分:第一部分:RABV強毒株感染小鼠腦組織蛋白表達譜分析。本研究利用i TRAQ LC-MS/MS定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對RABV標準攻擊毒株CVS-11感染后1、4、7天的小鼠腦組織進行蛋白表達譜分析。結(jié)果共鑒定到2,781個非冗余的宿主蛋白,經(jīng)定量分析后顯示共有104個宿主蛋白在感染后的3個時間點上出現(xiàn)差異表達,其中感染后1天有23個蛋白上調(diào),17個蛋白下調(diào);感染后4天有16個蛋白上調(diào),17個蛋白下調(diào);而感染后7天,有40個蛋白上調(diào)及16個蛋白下調(diào)。生物信息學(xué)分析顯示,差異蛋白主要與細胞骨架、免疫應(yīng)答、應(yīng)激反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝等功能相關(guān)。其中值得注意的是干擾素誘導(dǎo)GTPase家族成員干擾素誘導(dǎo)GTP酶M家族蛋白(IGRM)1、鳥苷酸結(jié)合蛋白(GBP)2、干擾素誘導(dǎo)GTP酶(IIGP1)、γ干擾素誘導(dǎo)GTP酶(IGTP)的表達量較未感染組明顯升高,且除GBP2外差異表達均具有連貫性。因此,選取8種已明確報道的與病毒感染相關(guān)的干擾素誘導(dǎo)GTPase家族成員進行轉(zhuǎn)錄水平上的驗證,結(jié)果顯示其表達水平均呈時間依賴性增強。通過進一步的篩選發(fā)現(xiàn)多種干擾素誘導(dǎo)GTPase均與自噬通路密切相關(guān),由此確定自噬為該研究接下來探討的重點。第二部分:RABV強、弱毒株感染小鼠腦組織蛋白表達譜比較。為探索RABV強、弱毒株之間致病性差異的宿主相關(guān)因子,該部分實驗分別選取標準攻擊毒株CVS-11株與實驗室致弱毒株SRV9株分別作為RABV強、弱毒株的代表,對兩者感染后1、4、7天的小鼠腦組織進行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)以未感染組小鼠腦組織蛋白表達譜為背景,標準攻擊毒株CVS-11感染組在3個時間點共鑒定到90個差異蛋白,而弱毒株SRV9的感染在3個時間點共鑒定到227個差異蛋白,表明弱毒株可誘導(dǎo)更廣泛的宿主蛋白譜變化。由于該部分實驗的主要目的是篩選RABV強、弱毒株間致病性差異的宿主相關(guān)因子,因此著重針對以SRV9感染后小鼠腦組織蛋白表達譜為背景鑒定到的差異蛋白進行生物信息學(xué)挖掘。通路分析結(jié)果顯示,差異蛋白主要靶向自噬及其相關(guān)通路,如自由基清除、核因子E2相關(guān)因子2(NRF2)-介導(dǎo)的氧化應(yīng)激等。對生物信息學(xué)結(jié)果進行總結(jié)發(fā)現(xiàn),自噬處于RABV感染的中心位置,發(fā)揮承上啟下的作用。該部分實驗強有力的提示自噬可能參與RABV感染過程,因此確定自噬與RABV感染的關(guān)系做為接下來研究的目標。第三部分:RABV感染對NA細胞自噬活性的影響。本研究第一和第二部分的RABV感染蛋白質(zhì)組學(xué)分析均提示細胞自噬可能參與RABV感染過程,因此第三部分實驗將回答RABV感染是否影響細胞自噬水平這個問題。該部分實驗中,選取小鼠神經(jīng)瘤(NA)細胞為體外模型,通過透射電鏡觀察自噬體的超微結(jié)構(gòu)、熒光顯微鏡觀察EGFP-LC3熒光斑點的聚集情況,并聯(lián)合應(yīng)用western blot方法檢測自噬標記分子LC3-II和自噬底物p62的表達量等多種手段評估RABV強、弱毒株感染后NA細胞的自噬水平。結(jié)果顯示,RABV感染NA細胞后,胞內(nèi)自噬體數(shù)量明顯增多,且實驗室致弱毒株SRV9誘導(dǎo)的自噬體的增多明顯高于標準攻擊毒株CVS-11株。綜上所述,RABV感染可以誘導(dǎo)自噬,且強、弱毒株之間存在差異。第四部分:細胞自噬對RABV復(fù)制及致病性的影響。首先利用細胞增殖和毒性檢測試劑盒CCK-8測定自噬調(diào)節(jié)劑處理后NA細胞的活性及利用RABV內(nèi)化實驗測定自噬調(diào)節(jié)劑對RABV內(nèi)化速率的影響,從而篩選出適用的自噬激動劑及抑制劑。接下來在RABV感染過程中以自噬調(diào)劑處理NA細胞,測定自噬活性改變對RABV復(fù)制的影響。此外,為排除藥物對細胞其他方面的非特異性影響,利用sh RNA對自噬關(guān)鍵基因Beclin 1進行沉默后檢測下調(diào)自噬水平對RABV復(fù)制的影響。結(jié)果顯示,調(diào)節(jié)細胞自噬對RABV在NA細胞上復(fù)制無影響。另外,該部分實驗亦對自噬調(diào)節(jié)劑對RABV在小鼠腦組織內(nèi)復(fù)制及對小鼠的致病性影響進行檢測。體內(nèi)實驗結(jié)果表明,自噬激動劑可以在不影響病毒復(fù)制的情況下增強RABV對小鼠的致死性。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

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1 李嶺;RABV感染小鼠腦組織蛋白質(zhì)組學(xué)分析及自噬與RABV復(fù)制關(guān)系研究[D];吉林大學(xué);2017年

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本文編號：1286171