本文關(guān)鍵詞：嗜熱真菌第3家族β-葡萄糖苷酶的多樣性和分子改造

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【摘要】：β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)是降解自然界中纖維物質(zhì)的關(guān)鍵限速酶,并且對于多種生物活性物質(zhì)具有轉(zhuǎn)化能力,在生物能源、食品保健和飼料行業(yè)都有廣闊的應(yīng)用前景。微生物來源的β-葡萄糖苷酶是非常重要的生物酶資源,對于微生物來源的β-葡萄糖苷酶的挖掘和新型β-葡萄糖苷酶的開發(fā)具有重要可持續(xù)發(fā)展意義。本研究以嗜熱真菌特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens Y1 GCMCC 4573)和籃狀菌(Talaromyces leycettanus JCM 12802)為材料,系統(tǒng)研究了第3家族β-葡萄糖苷酶的生化性質(zhì)、功能多樣性、底物結(jié)合關(guān)鍵氨基酸以及催化效率相關(guān)關(guān)鍵氨基酸,并成功對部分β-葡萄糖苷酶進行了分子改造。主要結(jié)果如下：(1)嗜熱真菌特異腐質(zhì)霉(H.insolens Y1 GCMCC 4573)第3家族β-葡萄糖苷酶多樣性和底物結(jié)合研究首次克隆了3個特異腐質(zhì)霉(H.insolens Y1)來源的第3家族β-葡萄糖苷酶基因,并將其在畢赤酵母中成功表達。分析表明,它們在序列上分屬于不同遺傳進化分支,在功能上也表現(xiàn)出一定的多樣性。3個重組酶都表現(xiàn)出高溫中性(50-60℃,pH 5.5-6.0)和葡萄糖耐受性好的特點,但底物特異性差異較大。HiBg13A和HiBg13C具有廣泛的底物特異性,對二糖底物和芳香基糖苷底物具有較好的水解能力,而HiBg13B僅對芳香基糖苷底物具有水解活性。3個重組酶中HiBg13C表現(xiàn)出最高的比活力(對pNPG 158.8 U/mg,對纖維二糖56.4 U/mmg)和催化效率(對pNPG 1557/s/mM,對纖維二糖23.0/s/mM),且能夠很好地協(xié)同纖維素酶促進纖維素降解,具有很好的應(yīng)用價值。此外,HiBg13B的Ile48、Ile278和Thr484與HiBg13A中對于氨基酸為點進行替換的突變體組合突變體獲得了對槐糖的水解活性,而對應(yīng)的HiBg13A的替換突變體嚴重失活。該項研究揭示了第3家族β-葡萄糖苷酶的序列多樣性與功能多樣性之間的關(guān)系,證明了與底物+1位配體單元結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點。(2)嗜熱真菌籃狀菌(T. leycettanus JCM12802)第3家族β-葡萄糖苷酶Bg13ApH穩(wěn)定性改造首次克隆了籃狀菌(T. leycettanus)第3家族β-葡萄糖苷酶Bg13A,并在畢赤酵母中成功表達。純化后的重組Bg13A表現(xiàn)出優(yōu)異的酶學(xué)特性,最適反應(yīng)溫度為75℃,最適pH為4.5,且具有良好的熱穩(wěn)定性,在60℃保持穩(wěn)定。重組工程菌在3L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)時,粗酶液酶活高達6000U/ml。Bg13A催化性能突出,對pNPG比活力為905 U/mg,催化效率kcat/Km值為9096/s/mM,對纖維二糖比活力為265.5U/mg,催化效率kcat/Km值為75.8/s/mM。其缺陷在于pH穩(wěn)定性極差。本研究通過構(gòu)建去除潛在的O-糖基化修飾位點的突變體證明了該酶在畢赤酵母中重組表達時發(fā)生過度的O-糖基化修飾,導(dǎo)致其pH穩(wěn)定性極差。兩個突變體均表現(xiàn)出大大改善的pH穩(wěn)定性,能夠在pH 3.0-10.0保持穩(wěn)定。由于其穩(wěn)定性的提高,突變體M1在酶解糖化試驗中表現(xiàn)優(yōu)于野生型Bg13A。在添加相同酶活單位的條件下,突變體M1與纖維素酶Celluclast 1.5L的協(xié)同效果與商業(yè)化β-葡萄糖苷酶Novozyme 188相當(dāng),表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。(3)嗜熱真菌籃狀菌(T. leycettanus JCM12802)第3家族β-葡萄糖苷酶Bgl3A對纖維二糖催化效率的改造籃狀菌(T. leycettanus)第3家族p-葡萄糖苷酶Bg13A因其突出的酶學(xué)性質(zhì)而具有巨大的開發(fā)價值。實驗數(shù)據(jù)顯示Bg13A對纖維二糖的催化效率遠低于對pNPG的催化效率,其主要原因是Bg13A對纖維二糖底物的親和力較低。為了針對其催化效率進行分子改造,通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和分子對接分析找出了多個與酶催化緊密相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基。進而,通過對催化口袋附近穩(wěn)定疏水區(qū)域的破壞,突變體M36E和M36N相比野生型Bg13A對纖維二糖的Km分別降低為5.0mM和4.7mM,催化效率均提高約2.3倍；通過對氫鍵網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵氨基酸殘基Arg65和Arg167成鍵能力的增強,突變體F66Y和E168Q相比野生型Bg13A對纖維二糖的親和力分別提高2.4倍和2倍,催化效率分別提高1.6和1.4倍。分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明,M36E和M36N主要通過增強疏水結(jié)合位點Phe258的柔性,提高其對纖維二糖底物的捕獲概率來提高酶對二糖底物的親和力,進而提高催化效率；F66Y和E168Q則主要通過增強Arg65-Phe67和Arg167-Tyr202之間形成的陽離子-π相互作用使催化口袋氫鍵網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵氨基酸殘基Arg65和Arg167的成鍵能力增強,提高酶對底物的親和力,進而提高催化效率。結(jié)合能計算結(jié)果也表明,所有優(yōu)勢突變體與底物的結(jié)合相較野生型Bg13A更為穩(wěn)定。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q936

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