發(fā)布時間：2017-12-12 17:44

  本文關鍵詞：拘束應激增加小鼠流感病毒易感性機制研究及小分子活性肽Carnosine的干預作用

  更多相關文章： 拘束應激 皮質酮 Mfn2 流感病毒 MAVS Carnosine

【摘要】：除了病毒本身的因素外,宿主自身的易感性在流感疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)病原體感染機體時,機體主要通過直接抗病毒作用與增強機體對病原體的耐受能力發(fā)揮自我保護作用。當機體無法有效發(fā)揮這兩種作用,會引起嚴重感染導致死亡,被稱為流感的“易感個體”。研究表明新生兒、老年人、患有基礎代謝疾病及疲倦或應激負荷下的人群屬于感染流感病毒的“易感人群”,且這部分人群感染流感后死亡率顯著升高,但關于這些因素是如何增加機體“易感性”的機理尚不明確。因此,深入研究流感“易感性”形成機制及如何降低機體“易感性”在防治流感病毒感染中具有重要意義。應激負荷能激活下丘腦-垂體-腎上腺(Hypothalamic pituitaryadrenal,HPA)軸增加糖皮質激素皮質酮(Cortisostone,CORT)的分泌,同時CORT能夠調控先天性免疫反應保護機體抵御病原體感染。前期研究發(fā)現(xiàn)拘束應激負荷能增加小鼠對流感病毒的易感性。因此,本課題以拘束應激負荷與CORT負荷建立小鼠與細胞“易感性”模型,探索CORT在拘束應激負荷增強機體流感“易感性”的作用及機制。首先,本論文研究了拘束應激負荷誘導的應激激素CORT對小鼠流感病毒“易感性”的影響。將小鼠放置于50mL通風良好的離心管中拘束負荷18 h,小鼠于給藥前1 d開始拘束負荷,拘束應激負荷18 h后第3 d以2×LD50的H1N1病毒經(jīng)滴鼻感染小鼠,實驗組小鼠于拘束負荷后開始每天皮下注射1 mg/kgCORT或25 mg/kg米非司酮(Mifepristone,RU486),連續(xù)給藥3 d,正常對照組、病毒組和拘束病毒模型組小鼠給予等量溶劑聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)。感染流感病毒后連續(xù)觀察21d或者4d,檢測小鼠感染流感病毒后的發(fā)病率、死亡率與肺組織中的病毒量(Nuclear protein,NP)變化。實驗結果表明,拘束應激負荷小鼠與CORT負荷小鼠感染流感病毒后發(fā)病率、死亡率明顯升高,肺組織中的病毒復制水平(NP蛋白表達)明顯增加,且肺部病理損傷顯著加劇,而皮質酮受體抑制劑RU486能夠改善上述過程。以上實驗結果提示,應激激素CORT增強了小鼠對流感病毒“易感性”。其次,研究應激激素CORT對線粒體抗病毒信號蛋白(Mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)通路的影響。病毒感染機體時,體內的MAVS被激活形成多聚體,mavs聚集體激活irf3與nf-κb誘導產(chǎn)生大量i型干擾素(interferon-i,ifn-i)與抗病毒蛋白(antiviralprotein,avp)從而抑制病毒的感染。本實驗探討了拘束應激負荷增加小鼠流感病毒“易感性”是否與應激誘導的cort調控mavs抗病毒信號通路活性有關。將昆明種(km)小鼠隨機分為以下4組:正常對照組(control),病毒組(virus),拘束病毒模型組(stress+virus),ru486組(stress+virus+ru486)。小鼠于給藥前1d開始拘束負荷,拘束負荷18h后第3d以2×ld50的h1n1病毒感染機體,實驗組小鼠于拘束負荷后開始每天皮下注射25mg/kgru486,連續(xù)給藥3d,正常對照組、病毒組和拘束病毒模型組給予等量溶劑peg。將小鼠于感染病毒后的第4d處死取肺組織,檢測肺組織中mavs及mavs聚集體蛋白表達水平。實驗結果顯示,病毒感染增強了小鼠肺組織中mavs及mavs聚集體蛋白表達;與病毒組相比,拘束病毒模型組小鼠肺組織中的mavs及mavs聚集體蛋白表達顯著下降,ru486上調了兩者蛋白表達。以上結果說明應激激素cort能夠通過抑制mavs蛋白及活性,降低機體抗病毒信號。mavs活化能夠促進irf3磷酸化與nf-κb活化,從而調控ifn-β應答。為了進一步考察應激誘導的cort降低ifn-β應答提高小鼠流感“易感性”是否受nf-κb調控,本研究采用nf-κb抑制劑bay11-7082探討nf-κb信號通路在cort負荷a549細胞感染流感后對ifn-β的影響。實驗結果表明,與單獨cort負荷細胞相比,cort負荷的a549細胞感染流感病毒后nf-κb蛋白表達增強,誘導炎癥因子(tnf-α與il-6)釋放增加;與cort病毒模型組細胞相比,nf-κb抑制劑bay11-7082顯著降低了細胞中nf-κb表達水平,同時tnf-α與il-6釋放減少,提示cort能直接激活體內的nf-κb信號誘導炎癥反應。但是bay11-7082對cort負荷的a549細胞感染流感病毒后np與ifn-β表達無影響,說明細胞中ifn-β應答受mavs調控而與nf-κb信號通路無關。以上結果表明拘束應激負荷誘導的應激激素cort一方面抑制了mavs抗病毒信號通路減少ifn-β應答,另一方面直接激活nf-κb信號通路誘導了炎癥因子釋放,兩者共同作用提高了機體流感“易感性”。再次,mavs抗病毒信號減弱是拘束應激負荷誘導應激激素cort降低流感病毒“易感性”的重要機制。流感病毒能利用蛋白泛素化途徑調控機體先天性免疫信號轉導,而線粒體融合蛋白2(mitofusin2,mfn2)能夠抑制mavs抗病毒信號降低ifn應答促進病毒感染。因此,本課題從拘束應激負荷與cort負荷對小鼠基因表達譜的影響,與體內mavs泛素化角度研究和探討mfn2在應激激素cort調控mavs泛素化中的作用。(1)首先采用小鼠表達譜測序對拘束應激負荷與cort負荷小鼠進行基因表達水平的檢測,發(fā)現(xiàn)cort負荷能夠明顯上調小鼠肺組織中與先天性免疫及抗病毒相關的vdac1、irf3、mfn2與jun基因水平,其中mfn2基因水平顯著上調,但是mavs基因水平無明顯影響,提示拘束應激負荷與cort負荷增強機體易感性可能與mfn2有關。接下來采用rt-pcr與westernblot方法檢測拘束應激負荷與cort負荷對小鼠與a549細胞中mfn2與mavs的基因與蛋白表達影響。體內外實驗結果顯示,cort負荷能增強mfn2基因與蛋白表達,對mavs基因表達無影響,但是降低mavs蛋白表達,提示mfn2可能與應激激素cort提高機體流感“易感性”相關。(2)采用pires2-egfp-mfn2質粒轉染a549細胞,探討過表達mfn2對流感感染機體“易感性”的影響。質粒轉染的a549細胞經(jīng)cort負荷后感染h1n1病毒,觀察細胞中np,ifn-β與ifitm3蛋白表達變化。實驗結果表明過表達mfn2細胞感染流感病毒后np表達顯著增強,ifn-β與ifitm3蛋白表達下降,說明應激激素cort上調了mfn2表達從而抑制了ifn-β應答。(3)進一步考察mfn2在cort調控mavs信號通路降低ifn-β應答中的作用。采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-ip)實驗驗證mfn2與mavs在體內相互作用,結果證明了mfn2與mavs在細胞體內相互結合。采用co-ip與westernblot法相結合測定應激激素cort對病毒感染小鼠肺組織中mavs泛素化的影響。實驗結果表明,與病毒組相比,拘束應激負荷與cort負荷小鼠肺組織中mavs泛素化顯著增強,以上結果提示mfn2可能通過促進mavs泛素化抑制機體抗病毒信號通路。(4)采用pires2-egfp-mfn2質粒轉染a549細胞,觀察過表達mfn2對cort負荷a549細胞感染病毒后mavs泛素化的影響。實驗結果顯示,mfn2過表達促進了a549細胞感染病毒后mavs泛素化,提示應激激素cort通過上調mfn2促進了mavs泛素化降解。最后,考察mfn2調控mavs信號通路在天然小分子活性肽肌肽(carnosine)保護拘束應激負荷小鼠流感感染中的作用研究。課題組前期建立拘束負荷小鼠流感易感性模型,并用此模型評價出了許多天然產(chǎn)物對流感易感性的保護作用。其中,課題組前期研究發(fā)現(xiàn)天然小分子活性肽carnosine具有抗應激與抗氧化等多種生理活性,且能夠提高流感感染小鼠的存活率,但是carnosine降低流感小鼠易感性是否與Mfn2調控MAVS信號通路有關尚未闡明。(1)采用拘束應激負荷小鼠感染流感病毒,觀察流感小鼠肺指數(shù)、病毒復制及肺部病理損傷情況。實驗結果顯示,carnosine顯著降低了拘束負荷小鼠感染流感病毒后的肺指數(shù)與病毒復制水平,減輕了肺部病理損傷。以上結果說明小分子活性肽carnosine能夠對流感感染的應激負荷小鼠發(fā)揮保護作用。(2)探討carnosine降低拘束應激負荷小鼠流感易感性是否與影響MAVS抗病毒信號通路有關。觀察應激負荷小鼠感染流感后肺組織中IFN-β應答與MAVS、p-IRF3、NF-κB與p-IκB蛋白表達變化情況。實驗結果表明,與模型組相比,carnosine增強了流感小鼠肺組織中IFN-β與IFITM3蛋白表達,上調了MAVS與p-IRF3蛋白表達水平,同時降低了NF-κB與p-IκB蛋白水平。以上結果說明carnosine能夠激活MAVS抗病毒信號通路促進IFN-β應答從而降低機體流感易感性。(3)探討Mfn2調控MAVS抗病毒活性在carnosine降低機體流感易感性中的作用。觀察應激負荷小鼠感染流感后肺組織中MAVS與MAVS聚集體及Mfn2蛋白表達變化。實驗結果顯示,與模型組相比,carnosine提高了流感小鼠肺組織中MAVS與MAVS聚集體蛋白表達,降低了Mfn2蛋白表達,說明carnosine能通過Mfn2上調MAVS活性增強IFN應答降低機體流感易感性。綜上所述,拘束應激負荷增加小鼠對流感病毒的易感性是通過CORT上調Mfn2介導MAVS泛素化抑制IFN應答。天然小分子活性肽carnosine通過下調Mfn2提高MAVS介導的IFN應答對流感感染應激負荷小鼠發(fā)揮保護作用。
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373.13

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 嚴燦,徐志偉,李艷,何彥麗,史亞飛,吳麗麗,王劍,潘毅;調肝健脾補腎方藥對反復心理應激大鼠的中樞調整作用[J];廣州中醫(yī)藥大學學報;2003年02期

，

本文編號：1283399