本文關(guān)鍵詞：沙門氏菌噬菌體fmb-p1生物學(xué)特性與噬菌機(jī)制及其在冷藏食品中的應(yīng)用研究

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【摘要】：由沙門氏菌引起的食源性疾病在全球范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的損失,對人們的健康和食品安全產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅。食品在加工、運(yùn)輸、銷售的過程中極易被沙門氏菌污染,而且沙門氏菌在自然環(huán)境中抗逆性強(qiáng),人或動物一旦接觸了含有沙門氏菌的糞便、土壤、食品或水皆可引發(fā)沙門氏菌病。目前抗生素是治療沙門氏菌病的主要物質(zhì)。而抗生素的濫用及過量使用導(dǎo)致了耐藥菌和多重耐藥菌的大量出現(xiàn),由其所引起的食源性疾病已成為當(dāng)今世界上最廣泛的公共衛(wèi)生問題之一。因此,探索開發(fā)新的無副作用或副作用小的抗菌物質(zhì)來取代或減少傳統(tǒng)殺菌方法和技術(shù)顯得非常重要。噬菌體作為細(xì)菌的天敵,鑒于其在控制各種病原菌特別是高耐藥性超級細(xì)菌方面的顯著效果,目前在全球范圍內(nèi)噬菌體的研究受到廣泛關(guān)注。本研究篩選出抑菌譜廣的沙門氏菌噬菌體,研究其生物特性、基因組學(xué)性質(zhì)、吸附學(xué)特性、對宿主菌的作用機(jī)制和殺菌作用特點(diǎn),并將其應(yīng)用于冷藏食品及其生產(chǎn)加工過程,降低食品中沙門氏菌的污染。主要研究結(jié)果詳述如下:1、沙門氏菌噬菌體的篩選與生物學(xué)特性研究以沙門氏菌為宿主菌,通過點(diǎn)斑法和雙層平板法,從南京周邊動物養(yǎng)殖場排水、河水和湖水樣品中篩選獲得沙門氏菌噬菌體12株。其中1株沙門氏菌噬菌體fmb-pl能夠裂解S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Anatum, S. Miami, S. Agona, S. Saintpaul and S.Paratyphi-C等7個血清型沙門氏菌。該噬菌體能在雙層平板中形成2mm左右清晰的噬菌斑,潛伏期為20min,爆發(fā)量為77±4PFU/cell,裂解能力較強(qiáng)。透視電鏡觀察表明其具有不可收縮的長尾和多面體頭部結(jié)構(gòu),是長尾科噬菌體(Siphoviridae)。沙門氏菌噬菌體fmb-p1環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng),能在40-70℃高溫下、3%-11%鹽濃度溶液、pH為5-9的溶液中保持活性,在-20、4和20℃條件下儲存半年均可保持1010PFU/mL的高滴度。沙門氏菌噬菌體fmb-p1高滴度原液制備較為方便,液體富集增殖和固體增殖方法都能獲得1010PFU/mL-1011PFU/mL的高滴度噬菌體懸液。2、沙門氏菌噬菌體fmb-p1鑒定與安全性評估驗證研究采用de novo從頭測序策略和基于Illumina二代測序的短序列的拼接軟件SOAPdenovo /Velvet以及Hiseq2500測序系統(tǒng)完成了噬菌體fmb-p1的全基因組測序。結(jié)果表明,噬菌體fmb-p1全基因組為雙鏈DNA,全長43327bp, GC平均含量為46.09%。該噬菌體基因組中含有60個ORF,占全長的80.15%,通過BLAST比對分析發(fā)現(xiàn),其中25個基因為已知功能基因,另外35個基因編碼假定蛋白。噬菌體fmb-p1是一株全新的噬菌體。噬菌體fmb-p1基因組和尾絲蛋白序列比對結(jié)果表明,fmb-p1與長尾科沙門氏菌噬菌體(Siphoviridae)有高度同源性,屬同一科噬菌體。噬菌體基因組限制性核酸內(nèi)切酶酶切和PCR結(jié)果表明,噬菌體fmb-p1不具有溶原性。基因組注釋結(jié)果和毒性基因PCR驗證結(jié)果表明,噬菌體fmb-p1是一株安全的噬菌體,具有作為生物殺菌劑的潛在應(yīng)用價值。3、沙門氏菌噬菌體fmb-p1的吸附效率和吸附位點(diǎn)研究噬菌體吸附動力學(xué)結(jié)果表明,噬菌體fmb-p1的吸附速率極高,5min就可以達(dá)到90%以上,之后一直保持90%以上的吸附效率。在吸附過程中總有部分噬菌體沒有被吸附,呈現(xiàn)游離狀態(tài)。噬菌體fmb-p1的吸附過程符合吸附-解吸附-不可逆結(jié)合模型的理論預(yù)測結(jié)果。噬菌體fmb-p1的吸附效率測試結(jié)果表明,噬菌體的吸附效率受到宿主菌菌株、菌濃度等影響十分顯著,而溫度等理化因素影響較小。噬菌體fmb-p1對其宿主菌沙門氏菌的吸附效率高達(dá)8 0 %以上,對于非宿主沙門氏菌或其它非沙門氏菌的吸附效率非常低,低于30%。當(dāng)宿主菌濃度在107CFU/mL以上時,噬菌體的吸附效率均在80%以上當(dāng)宿主菌濃度低于107CFU/mL時,噬菌體的吸附效率迅速下降至30%左右。通過吸附干擾實(shí)驗、電鏡觀察和基因測序及序列比對等手段,確定噬菌體fmb-p1的吸附受體為脂多糖。4、沙門氏菌噬菌體fmb-p1對沙門氏菌作用的分子機(jī)理研究通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù),研究了噬菌體fmb-p1處理對沙門氏菌作用的分子機(jī)理。結(jié)果表明,除基因lpxA、msbA以外,噬菌體fmb-p1顯著降低了沙門氏菌脂多糖合成基因的表達(dá)量,特別是與O抗原相關(guān)的基因,如rfc、rfbA和rfbC均可下調(diào)6 log2 fold以上。不同處理條件下,噬菌體處理顯著降低了沙門氏菌的脂多糖合成基因表達(dá)量;但在生理鹽水中和噬菌體處理沙門氏菌6h兩種情況下,噬菌體處理使得沙門氏菌的脂多糖合成基因表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào),這可能與宿主菌的生理狀態(tài)有關(guān)。研究了噬菌體fmb-p1對沙門氏菌相關(guān)毒性基因表達(dá)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),噬菌體fmb-p1顯著降低了沙門氏菌4個毒力島基因和毒性質(zhì)粒的表達(dá)量。噬菌體fmb-p1對沙門氏菌噬菌體抗性基因表達(dá)量的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn),噬菌體fmb-p1處理沙門氏菌顯著上調(diào)了沙門氏菌的噬菌體抗性基因 lexA、recA、CRISPR/Cas1、hsdS、hsdR、hsdM、mod 和 res 等的表達(dá)量。因此,沙門氏菌在抵御噬菌體侵襲時,同時啟動了吸附抑制、降解外源核酸和應(yīng)急救援等抗性機(jī)制。噬菌體fmb-p1對其抗性菌株關(guān)鍵基因表達(dá)量的研究結(jié)果表明,噬菌體fmb-p1顯著降低了其宿主菌抗性菌株13個脂多糖合成基因的表達(dá)量。噬菌體fmb-p1顯著降低了沙門氏菌4個毒力島基因和毒性質(zhì)粒的表達(dá)量。噬菌體fmb-p1處理沙門氏菌顯著上調(diào)了沙門氏菌的噬菌體抗性相關(guān)基因lexA、recA、CRISPR/Cas1、hsdS、hsdR、hsdM、mod和res等的表達(dá)量。因此,這些結(jié)果進(jìn)一步驗證了噬菌體fmb-p 1對沙門氏菌的作用分子機(jī)制。5、沙門氏菌噬菌體fmb-p1在溶液體系中的殺菌作用研究研究了噬菌體fmb-p1在溶液體系中的殺菌作用。結(jié)果表明,噬菌體fmb-p1可降低鼠傷寒沙門氏菌2-5.5 log CFU/mL,降低腸炎沙門氏菌2.14-3.68 log CFU/mL,降低圣保羅沙門氏菌0.87-0.93 log CFU/mL。感染復(fù)數(shù)(MOI)對噬菌體的殺菌作用影響最顯著,高M(jìn)OI ( 105-106)條件下,噬菌體可降低沙門氏菌2-5 log CFU/mL甚至完全消除沙門氏菌的污染;低MOI (≤1 )條件下,噬菌體fmb-p1對沙門氏菌的防控效果較差,只能減少沙門氏菌1 log CFU/mL及以下。而pH、鹽度對噬菌體fmb-p1的殺菌作用影響最小。溫度對噬菌體作用的效果也有一定影響,在4℃噬菌體可以控制宿主菌數(shù)量在較低水平。噬菌體fmb-p1的殺菌動力學(xué)結(jié)果表明,噬菌體fmb-p1殺菌作用時間累積作用較弱,只有MOI達(dá)到一定數(shù)量級后(106),噬菌體的殺菌作用才顯著。噬菌體fmb-p1對不同血清型沙門氏菌菌株殺滅作用存在顯著差異,對鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌殺滅作用最好,對圣保羅沙門氏菌殺滅作用相對較差。噬菌體fmb-p1與防腐劑山梨酸鉀、苯甲酸鈉抑菌效果的比較結(jié)果表明,噬菌體fmb-p1可以殺死宿主沙門氏菌,顯著降低其含量;而山梨酸鉀和苯甲酸鈉只能抑制沙門氏菌的增長,不能減少沙門氏菌數(shù)量。噬菌體fmb-p1能夠減少沙門氏菌5 logCFU/mL以上,表明其具備作為能被監(jiān)管部門認(rèn)可的控制致病菌的新殺菌劑的潛力。6、沙門氏菌噬菌體fmb-p1在冷藏食品中的應(yīng)用研究本研究發(fā)現(xiàn)噬菌體fmb-p1在冷藏食品具有較好的防控沙門氏菌效果,可以顯著降低雞肉、牛奶、鴨肉和冷鮮豬肉中的沙門氏菌含量。噬菌體fmb-p 1對雞肉中沙門氏菌的殺菌結(jié)果表明,噬菌體可以顯著降低雞肉中沙門氏菌的含量約2-3 log CFU/g;在低溫條件下,可使雞肉中的沙門氏菌處于檢測限以下。噬菌體fmb-p1對牛奶中沙門氏菌的殺菌結(jié)果表明,噬菌體可以顯著降低牛奶中的沙門氏菌含量約1.7 log CFU/mL;在低溫儲存一個月的期間內(nèi),噬菌體使牛奶中的沙門氏菌一直處于檢測限以下。噬菌體fmb-p1對鴨肉中沙門氏菌的殺菌結(jié)果表明,噬菌體可以顯著降低鴨肉中的沙門氏菌含量約2.8-4.5 log CFU/g,而山梨酸鉀只能減少沙門氏菌0.12-0.85 log CFU/g;噬菌體的濃度越高,殺菌效果越好;在低溫條件下,噬菌體處理樣品中沙門氏菌沒有恢復(fù)生長現(xiàn)象出現(xiàn),提高了鴨肉的質(zhì)量安全水平。噬菌體fmb-p 1聯(lián)合乳酸鏈球菌素和山梨酸鉀對冷鮮肉中沙門氏菌的殺菌結(jié)果表明,噬菌體可以顯著降低冷鮮肉中的沙門氏菌至檢測限以下,約2-3 log CFU/g,而乳酸鏈球菌素和山梨酸鉀對冷鮮肉中的沙門氏菌無顯著影響。噬菌體聯(lián)用乳酸鏈球菌素和山梨酸鉀可以顯著降低冷鮮肉中的菌落總數(shù)(2 log CFU/g ),抑制冷鮮肉的氧化,保持冷鮮肉的感官和質(zhì)量品質(zhì),延長冷鮮肉貨架期至14d。噬菌體處理對冷鮮肉的感官品質(zhì)無不良影響。噬菌體在冷鮮肉中能夠保持?jǐn)?shù)量穩(wěn)定,不會受到乳酸鏈球菌素和山梨酸鉀的影響。因此,上述結(jié)果表明,噬菌體fmb-p1在冷藏食品致病菌的控制中具有巨大的應(yīng)用潛力。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TS201.3

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1 汪昌保;沙門氏菌噬菌體fmb-p1生物學(xué)特性與噬菌機(jī)制及其在冷藏食品中的應(yīng)用研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 黃廣濤;噬菌體在燒傷泛耐藥細(xì)菌感染治療中的應(yīng)用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2017年

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本文編號：1280354