本文關(guān)鍵詞：長葉紅砂黃酮類化合物合成相關(guān)基因功能分析及其對逆境脅迫的響應(yīng)

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【摘要】：植物通過積累多種小分子次生代謝產(chǎn)物,保護其抵抗不同的生物及非生物脅迫。在這些小分子化合物中,黃酮類化合物由于普遍存在性和化學結(jié)構(gòu)多樣性,在多種植物中得到廣泛的研究。但研究都主要集中在模式植物和農(nóng)作物中,對野生抗逆植物的研究卻十分少見。強旱生泌鹽鹽生植物長葉紅砂(Reaumuria trigyna)是我國東阿拉善-西鄂爾多斯特有野生植物,對鹽漬荒漠環(huán)境具有極強的適應(yīng)性。是研究次生代謝產(chǎn)物響應(yīng)植物抗逆機制的良好材料。本論文在對長葉紅砂鹽脅迫前后轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析的基礎(chǔ)上,篩選出9個長葉紅砂黃酮醇合成途徑中的差異表達基因(Differentially Expressed Gene, DEG,|log2Ratio|≥1)。分析他們在UV-B和鹽脅迫前后的表達量變化,對長葉紅砂黃酮合成基因進行初步抗逆功能驗證。通過高效液相色譜及質(zhì)譜分析初步鑒定長葉紅砂黃酮類化合物成分,比較UV-B和鹽脅迫前后黃酮類化合物成分的變化,發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物在植物抵抗非生物脅迫中的作用。克隆黃酮類合成關(guān)鍵酶原花青素雙加氧酶基因RtLDOX和苯丙氨酸裂解酶基因RtPAL1,分析這兩個基因的序列信息、系統(tǒng)進化、表達水平及其酶的催化活性。轉(zhuǎn)化擬南芥突變體,鑒定RtLDOX生理調(diào)節(jié)功能及抗鹽脅迫能力,探討其在擬南芥中的催化能力及抵抗非生物脅迫過程中發(fā)揮的作用。主要研究結(jié)果如下：1.對長葉紅砂鹽脅迫前后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中黃酮類化合物合成相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子進行生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)118條unigenes可能參與異黃酮、黃酮醇和花青素三種黃酮類化合物合成途徑。其中47條unigenes與黃酮醇合成相關(guān),這些黃酮醇合成相關(guān)基因在鹽脅迫后70%都顯著上調(diào)表達。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選665條unigenes被注釋編碼長葉紅砂MYB、WD40、bHLH和WRKY四個轉(zhuǎn)錄因子家族成員,從中發(fā)現(xiàn)13條unigenes可能調(diào)控黃酮類化合物合成途徑。2.篩選出9個黃酮醇合成關(guān)鍵酶基因RtC4H、RtCHS、RtF3H3、RtFLS1、 RtFLS2、RtF3'5'H、RtF3'H、RtOMT和RtMYBF1,定量RT-PCR (quantitative RT-PCR, qPCR)分析顯示這9個基因在不同程度UV-B照射和鹽處理后基因表達量顯著升高,同時伴隨著長葉紅砂總黃酮醇及其抗氧化能力的增加。DPPH分析顯示長葉紅砂黃酮類化合物具有極強的抗氧化能力,比模式植物擬南芥的抗氧化能力高出7.25倍。UPLC-QQQ-MS分析檢測發(fā)現(xiàn)四種黃酮醇成分蘆丁,異鼠李-3-新橙皮苷、金絲桃苷和楊梅素在UV-B和NaCl處理后含量顯著升高。3.利用RT-PCR和RACE (Rapid amplification of cDNA ends)克隆黃酮類化合物合成關(guān)鍵酶基因RtLDOX的cDNA全長序列,該基因長1441b p,編碼362個氨基酸。分析RtLDOX基因的啟動子序列,發(fā)現(xiàn)其中含有W-box、MYB和LTRE等逆境脅迫響應(yīng)元件。RtLDOX表達分析結(jié)果顯示,短時間干旱、高鹽、UV-B及低溫處理都能誘導(dǎo)RtLDOX基因表達量升高,特別在鹽處理后其表達量顯著升高,約為對照的25倍。將RtLDOX在大腸桿菌中功能表達,獲得與預(yù)期大小一致的His-RtLDOX重組蛋白。通過His標簽純化RtLDOX重組蛋白,用其催化柚皮素、二氫楊梅素和二氫槲皮素,發(fā)現(xiàn)RtLDOX具有F3H酶催化活性,能催化柚皮素生成二氫山奈酚,但對其他兩種底物沒有催化能力。4.RtLDOX轉(zhuǎn)化擬南芥LDOX突變體(transparent testa 11-11,tt11-11),獲得穩(wěn)定遺傳的RtLDOX陽性轉(zhuǎn)化植株。分析陽性轉(zhuǎn)化植株發(fā)現(xiàn),該基因能互補擬南芥LDOX突變體種子恢復(fù)合成花青素和原花青素,使種子顏色幾乎恢復(fù)正常水平。在鹽脅迫下,發(fā)現(xiàn)RtLDOX轉(zhuǎn)基因植株比tt11-11和野生型(Wild-type,WT)具有更高的生物量和黃酮類化合物含量。通過檢測黃酮類化合物對自由基DPPH清除能力,發(fā)現(xiàn)鹽脅迫能增強RtLDOX轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化能力。由此可見,RtLDOX能夠通過增加植物次生代謝產(chǎn)物黃酮類化合物含量,增強植物抗氧化能力,提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽脅迫的耐受性。5.在UV-B照射后,發(fā)現(xiàn)長葉紅砂黃酮類化合物合成關(guān)鍵酶RtPAL酶活性顯著增加,24 h脅迫后酶活性約為對照組的2.5倍。分析長葉紅砂RtPALs基因家族成員RtPAL1、RtPAL2和RtPAL3在UV-B脅迫后的表達水平,結(jié)果顯示RtPAL2和RtPAL3在脅迫后的表達水平并沒有顯著變化,而RtPAL1在UV-B脅迫后表達量增加,顯著高于對照水平,推測RtPAL1可能是RtPAL酶活性在UV-B脅迫下增加的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因,在植物抵抗紫外脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。克隆獲得RtPAL1基因序列2055 bp,編碼684個氨基酸；構(gòu)建RtPALl植物表達載體pPZP221-RtPAL1,將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,為隨后RtPAL1基因抗逆功能鑒定奠定基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

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