本文關(guān)鍵詞：小麥非生物脅迫相關(guān)LEA蛋白WZY1-2與WRAB18的功能研究

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【摘要】：在植物的整個(gè)生命過程中,常會(huì)遭遇干旱、高鹽、高溫、冷害以及病蟲害等逆境脅迫,影響其正常生長(zhǎng)。逆境可造成植物細(xì)胞不同程度的損傷,嚴(yán)重時(shí)將直接導(dǎo)致植株的死亡。逆境對(duì)植物的傷害主要表現(xiàn)在細(xì)胞脫水、膜系統(tǒng)遭到破壞、酶活性受影響以及胞內(nèi)物質(zhì)代謝紊亂等。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中也形成了各種防御機(jī)制來抵制這些不利因素對(duì)其自身的影響。胚胎發(fā)育晚期豐富表達(dá)蛋白(LEA蛋白),作為一類逆境相關(guān)蛋白,在植物逆境生理調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用。為探索該家族蛋白在植物逆境脅迫中發(fā)揮的功能,本論文以LEA蛋白第二家族成員WZY1-2蛋白和第三家族成員WRAB18蛋白為研究對(duì)象,對(duì)二者在植物逆境脅迫下的功能進(jìn)行了探討。WZY1-2蛋白,為L(zhǎng)EAⅡ家族蛋白(又稱脫水素、脫水蛋白)成員之一,具有該家族典型的保守序列:K片段和S片段,屬于SK 3型脫水素,可受多種逆境信號(hào)分子誘導(dǎo)表達(dá)。本研究對(duì)脫水蛋白WZY1-2及其K、S片段分別缺失的衍生蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)的定位和存在形式進(jìn)行了探討,確定了WZY1-2蛋白在細(xì)胞中的定位及存在形式,并揭示了K片段或S片段的缺失對(duì)WZY1-2蛋白的亞細(xì)胞定位以及存在形式的影響;通過在大腸桿菌和本氏煙草細(xì)胞中對(duì)WZY1-2蛋白進(jìn)行過表達(dá),研究其在干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫條件下對(duì)原核和真核生物抗逆性的影響。此外,本研究還通過蛋白與核酸互作的免疫共沉淀技術(shù)對(duì)脫水蛋白WZY1-2在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)理進(jìn)行了初步探究。研究結(jié)果如下:1.本研究從鄭引1#小麥中克隆獲得wzy1-2基因ORF序列并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),SDS-PAGE中蛋白大小為理論分子量大小的二倍,通過雙分子熒光互補(bǔ)(Bi FC)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)WZY1-2蛋白以同源二聚體的形式存在于植物細(xì)胞。以wzy1-2基因ORF序列為模板,利用重疊延伸PCR技術(shù)對(duì)wzy1-2基因K、S片段分別進(jìn)行缺失,獲得wzy1-2基因衍生物wzy1-2?K和wzy1-2?S,對(duì)二者分別進(jìn)行二聚化驗(yàn)證,結(jié)果顯示,分別缺失了K、S片段的衍生蛋白WZY1-2?K和WZY1-2?S在煙草葉片細(xì)胞內(nèi)依然以二聚體的形式存在,該現(xiàn)象表明K、S片段并不影響脫水蛋白WZY1-2的同源二聚化。2.分別構(gòu)建WZY1-2、WZY1-2?K以及WZY1-2?S蛋白與GFP融合的表達(dá)載體,通過在煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位分析,結(jié)果顯示,WZY1-2與WZY1-2?K蛋白定位于細(xì)胞核中。部分WZY1-2?S蛋白在細(xì)胞核中定位,但也有部分WZY1-2?S蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)膜和胞質(zhì)中,由此可見,K片段對(duì)WZY1-2蛋白的核定位并無影響,而S片段能夠影響WZY1-2的蛋白定位,但并不是決定因素。3.將WZY1-2蛋白過表達(dá)的大腸桿菌BL21(DE3)菌株與作為對(duì)照的轉(zhuǎn)p ET28a空載菌株同時(shí)進(jìn)行干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫,通過對(duì)比菌株生長(zhǎng)狀況,證明WZY1-2蛋白能夠在逆境條件下提高大腸桿菌的生存能力;構(gòu)建wzy1-2轉(zhuǎn)基因載體,利用農(nóng)桿菌葉盤浸染,通過組織培養(yǎng)獲得wzy1-2轉(zhuǎn)基因煙草,以野生型煙草為對(duì)照,通過對(duì)煙草生長(zhǎng)表型、根長(zhǎng)、發(fā)芽率、種子活力以及氧化脅迫相應(yīng)生理指標(biāo)進(jìn)行分析,表明脫水蛋白WZY1-2可在多種非生物脅迫下增強(qiáng)煙草的抗逆性。4.利用Ni2+柱對(duì)原核表達(dá)獲得的WZY1-2蛋白進(jìn)行純化,并制備特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),將WZY1-2蛋白與低溫脅迫36 h后小麥葉片基因組DNA共同孵育,對(duì)瓊脂糖珠所捕獲復(fù)合物分別進(jìn)行核酸和蛋白電泳檢測(cè),結(jié)果顯示,脫水蛋白WZY1-2能夠與核酸結(jié)合。WRAB18蛋白,屬于LEAⅢ蛋白家族,具有LEAⅢ家族保守氨基酸序列(TAQAAKEKAGE)。本研究確定了WRAB18蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)的定位及其在干旱、高鹽、高溫和低溫條件下,對(duì)乳酸脫氫酶(LDH)活性的保護(hù)作用。將WRAB18蛋白在大腸桿菌和煙草中進(jìn)行過表達(dá),探索其在干旱、高鹽、高溫和低溫四種非生物脅迫條件下對(duì)原核和真核生物的作用。同時(shí),本研究克隆獲得了WRAB18基因全長(zhǎng)及其上游啟動(dòng)子序列,并對(duì)啟動(dòng)子序列所包含的順式作用元件進(jìn)行分析。研究結(jié)果如下:1.構(gòu)建WRAB18蛋白C端GFP融合表達(dá)載體WRAB18-p A7GFP,通過農(nóng)桿菌菌液注射使GFP::WRAB18融合蛋白在煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)。在GFP激光通道和m Cherry通道下,利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)煙草葉片細(xì)胞原生質(zhì)體中GFP::WRAB18融合蛋白和質(zhì)體定位蛋白Marker(pt-rk CD3-999)進(jìn)行共定位觀察,結(jié)果顯示,WRAB18蛋白定位于煙草葉片細(xì)胞質(zhì)體中。2.將純化的WRAB18蛋白與乳酸脫氫酶(LDH)溶液分別在干燥、高鹽、高溫和低溫條件下共同孵育,酶活性分析表明,逆境條件下,含WRAB18蛋白的反應(yīng)體系中LDH的酶活性明顯高于不含WRAB18蛋白的對(duì)照組。3.將WRAB18蛋白分別在大腸桿菌BL21(DE3)和煙草中進(jìn)行過表達(dá),對(duì)大腸桿菌菌株以及轉(zhuǎn)基因煙草分別進(jìn)行干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫,與對(duì)照組進(jìn)行比較,結(jié)果顯示W(wǎng)RAB18蛋白的過表達(dá)可在多種逆境脅迫下提高原核和真核細(xì)胞的抗逆性。4.以小麥葉片基因組DNA為模板,克隆獲得WRAB18基因的全長(zhǎng)序列610 bp,其中包含1個(gè)100 bp的內(nèi)含子區(qū)域和2個(gè)分別為60 bp、450 bp的外顯子區(qū)域�？寺～@得WRAB18基因上游2000 bp序列,經(jīng)Plant CARE Database分析顯示,該序列包含TATA-box和CAAT-box等啟動(dòng)子保守元件,并含有逆境脅迫相關(guān)順式作用元件:ABREs、GARE、LTREs、MBS等。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)干旱、高鹽、高溫和低溫四種非生物脅迫后小麥幼苗葉片中WRAB18基因表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果表明WRAB18基因可受上述4種脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S512.1;Q946.1

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1 王曉宇;小麥非生物脅迫相關(guān)LEA蛋白WZY1-2與WRAB18的功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：1277454