本文關(guān)鍵詞：基于非洲豬瘟病毒P54蛋白抗原表位的ELISA檢測(cè)方法建立及應(yīng)用

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【摘要】：非洲豬瘟(African Swine Fever)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus)引起的家豬和野豬出現(xiàn)一系列綜合征的傳染病,各年齡段豬只均可發(fā)病。急性癥狀以高熱、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血及高死亡率為特征。2007年后傳入東歐及高加索地區(qū),呈現(xiàn)地方流行的態(tài)勢(shì)。目前普遍擔(dān)心由于國(guó)際貿(mào)易活動(dòng)的增加以及養(yǎng)殖豬只數(shù)量的增長(zhǎng),非洲豬瘟可能會(huì)穿越歐洲進(jìn)入亞洲,特別是東亞。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將非洲豬瘟列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病,而在我國(guó)動(dòng)物疫病病原微生物名錄中也列為一類動(dòng)物疫病。當(dāng)前的動(dòng)物疫病診斷技術(shù)中,ELISA方法因其具有敏感、特異、快速和易于標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn),且可以使用自動(dòng)化檢測(cè)設(shè)備,從而更適合于大量動(dòng)物群體樣本檢測(cè)的需要,是當(dāng)前在動(dòng)物疫病的檢疫和監(jiān)測(cè)中應(yīng)用最為廣泛的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù),基于ELISA技術(shù)的試劑盒仍然是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外動(dòng)物疫病診斷試劑市場(chǎng)的主要產(chǎn)品,市場(chǎng)需求及應(yīng)用前景巨大。本研究首先篩選非洲豬瘟疫病病原重要靶標(biāo)基因和重組抗原,制備特異性單克隆抗體,建立我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的非洲豬瘟疫病抗原和抗體試劑,研發(fā)非洲豬瘟重要外來(lái)動(dòng)物疫病新型診斷技術(shù)產(chǎn)品,以期有效防止外來(lái)疫病傳入我國(guó),及時(shí)準(zhǔn)確地掌握進(jìn)出境貿(mào)易中疫情疫病狀況。研究利用pET-52b(+)原核表達(dá)系統(tǒng)成功將非洲豬瘟病毒特異性P54蛋白實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá),純化后,經(jīng)免疫印跡試驗(yàn)證實(shí)P54重組蛋白具有反應(yīng)原性,可作為建立體外診斷方法所需要的抗原。研究還將非洲豬瘟病毒P54基因成功導(dǎo)入桿狀病毒,通過(guò)感染Sf9昆蟲細(xì)胞獲得重組蛋白P54的真核細(xì)胞表達(dá)載體,SDS-PAGE電泳試驗(yàn)結(jié)果表明其表達(dá)量較低,也未能獲得純化的目的蛋白。免疫印跡試驗(yàn)證實(shí)真核細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白P54具有較好的反應(yīng)原性,可用于本研究在單克隆抗體制備時(shí)的抗原篩選。研究分析了非洲豬瘟病毒P54蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),推測(cè)非洲豬瘟病毒P54蛋白可能含有6個(gè)B細(xì)胞抗原表位。通過(guò)間接ELISA方法證實(shí),該6處抗原位點(diǎn)可以與非洲豬瘟病毒陽(yáng)性血清發(fā)生特異性結(jié)合。分析發(fā)現(xiàn)了一處保守性位點(diǎn),因此在制備單克隆抗體時(shí)進(jìn)行了有針對(duì)性的篩選,獲取特定抗原位點(diǎn)的單克隆抗體。研究用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組P54蛋白免疫小鼠后,經(jīng)證實(shí)其具有良好的免疫原性,并挑取了血清抗體水平高的小鼠,取其脾細(xì)胞作細(xì)胞融合。又利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白P54、真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白P54以及人工合成特定序列的抗原表位多肽三種篩選方法,獲取了2株特異性強(qiáng)、背景清晰的雜交瘤細(xì)胞株,且2株雜交瘤細(xì)胞株針對(duì)不同的抗原位點(diǎn),目前均已保存在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,編號(hào)為CCTCC NO:C2014212和CCTCC NO:C2014213。研究采用美國(guó)伯樂ProteinOn XPR36蛋白質(zhì)大分子相互作用系統(tǒng),利用蛋白質(zhì)表面等離子體共振光學(xué)生物傳感技術(shù)對(duì)獲取到的1株單克隆抗體2E4與預(yù)測(cè)的多條非洲豬瘟病毒P54蛋白抗原位點(diǎn)多肽進(jìn)行相互作用,結(jié)果成功獲取并驗(yàn)證了非洲豬瘟病毒P54蛋白中一處保守抗原位點(diǎn),并解析了該位點(diǎn)構(gòu)成的最小必須氨基酸個(gè)數(shù)和序列。將該段氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中所有非洲豬瘟P54蛋白氨基酸序列(共197條)進(jìn)行BLAST比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該段氨基酸序列在目前世界流行的非洲豬瘟病毒株中非常保守,因此其對(duì)應(yīng)的單克隆抗體是建立檢測(cè)非洲豬瘟抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的理想蛋白。本研究篩選出ELISA最佳包被抗原為原核表達(dá)的非洲豬瘟病毒P54蛋白,其最佳包被濃度為2.5μg/mL,并利用本研究獲取的2E4單克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)性酶標(biāo)單抗,優(yōu)化了競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)流程,確定了結(jié)果判定閾值,建立了檢測(cè)非洲豬瘟病毒抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。該方法采用的酶標(biāo)單抗所針對(duì)的抗原位點(diǎn)非常保守,理論上能檢測(cè)到世界目前所有流行非洲豬瘟病毒株的陽(yáng)性血清。同時(shí)該方法特異性強(qiáng),達(dá)到100%;靈敏度高,可達(dá)96.22%;與西班牙INGENASA公司生產(chǎn)的檢測(cè)非洲豬瘟競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒的符合率可達(dá)到98.13%。臨床應(yīng)用中,檢測(cè)了1574份豬血清田間樣本,結(jié)果均為陰性。研究為有效防止非洲豬瘟病毒傳入中國(guó),及時(shí)掌握進(jìn)出境貿(mào)易中疫情疫病狀況,提供了準(zhǔn)確、可靠且具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗體檢測(cè)方法。本研究建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法已成為深圳市市場(chǎng)監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)化指導(dǎo)性技術(shù)文件《非洲豬瘟病毒抗體檢測(cè)阻斷酶聯(lián)免疫吸附法》(SZDB/Z 131-2015),并于2015年3月發(fā)布實(shí)施�？蔀樯钲谑心酥寥珖�(guó)防范非洲豬瘟的傳入提供技術(shù)支持。
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張彩虹;祝賀;高又文;陶虹;劉建利;宗卉;楊俊興;曹琛福;曾少靈;阮周曦;呂建強(qiáng);;抗非洲豬瘟病毒VP73蛋白雞卵黃抗體的制備及鑒定[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2015年08期

2 曹琛福;梁云浩;花群俊;呂建強(qiáng);孫潔;廖立珊;唐金明;張彩虹;楊俊興;張桂紅;;非洲豬瘟病毒p54蛋白抗原表位預(yù)測(cè)及鑒定[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年11期

3 靳雯雯;楊俊興;花群俊;劉建利;曹琛福;曹勝波;曾少靈;陶虹;阮周曦;呂建強(qiáng);;非洲豬瘟病毒抗體檢測(cè)間接ELISA方法的建立[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年07期

4 梁云浩;曹琛福;陶虹;呂建強(qiáng);唐勇;;非洲豬瘟病毒P54蛋白的真核表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2014年04期

5 張?chǎng)斡?左偉勇;朱善元;夏曉莉;孫懷昌;;非洲豬瘟病毒p54抗體膠體金試紙檢測(cè)方法的建立[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年04期

6 張?chǎng)斡?陳宇;劉文俊;夏曉莉;孫懷昌;;非洲豬瘟病毒E183L、B602L、K205R和A104R基因表達(dá)及診斷抗原篩選[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;2014年03期

7 曹琛福;梁云浩;陶虹;花群義;曾少靈;楊俊興;陳兵;張桂紅;呂建強(qiáng);;非洲豬瘟病毒p54基因的原核表達(dá)及其抗體的間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2014年02期

8 鄒年莉;王富妍;段真真;郭明萍;吳瑞婷;付潤(rùn)饒;文心田;曹三杰;黃勇;;雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2014年01期

9 崔尚金;胡泉博;劉業(yè)兵;;非洲豬瘟病毒高效納米PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2012年10期

10 陳軼;王君瑋;曹金山;鄒艷麗;吳曉東;;非洲豬瘟病原學(xué)及單克隆抗體制備技術(shù)研究進(jìn)展[J];畜牧與飼料科學(xué);2012年04期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 靳雯雯;非洲豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立及其桿狀病毒載體疫苗的構(gòu)建[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 苗富春;小反芻獸疫病毒、非洲豬瘟病毒、西尼羅病毒、亨德拉病毒及尼帕病毒并聯(lián)熒光定量PCR方法建立[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：1270552