本文關(guān)鍵詞：斑馬魚核糖核酸酶1和5在胚胎發(fā)育早期的功能研究

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【摘要】：斑馬魚(zebrafish, Danio rerio)核糖核酸酶A超家族(RNase A superfamily)由Elio Pizzo等于2006年首次發(fā)現(xiàn)。迄今為止已報道的成員一共有5名,分別被命名為zebrafish RNase1/2/3/4/5(ZF-RNase-1/2/3/4/5)。作為人類血管生成素(human angiogenin, hANG)的同源基因,它們與hANG在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和細胞水平功能學方面有相當高的相似程度。考慮到小鼠體內(nèi)存在6個hANG同源基因和3個假基因,進行hANG功能學研究較為復(fù)雜,我們擬用斑馬魚作為體內(nèi)功能研究的動物模型。為此,本論文在初略探明斑馬魚胚胎發(fā)育早期ZF-RNases表達情況的基礎(chǔ)上,對2個在該時期顯著表達的成員——ZF-RNase-1和5進行了深入研究,不僅構(gòu)建了兩者的時空表達模式,還探索了它們在該時期的體內(nèi)生物學功能。 首先,我們從AB品系野生型斑馬魚整胚的cDNA中克隆得到ZF-RNases的表達序列(expressed sequence tags, ESTs),利用半定量PCR(semi-quantitative reverse transcription and PCR, semi-quantitative RT-PCR)的方法明確了5名成員中僅ZF-RNase-1/3/5在斑馬魚胚胎發(fā)育早期顯著表達。在此基礎(chǔ)上,我們利用實時熒光定量PCR(Real-time PCR, qRT-PCR)技術(shù)研究了ZF-RNase-1/3/5在受精后0-72小時的時間表達譜。結(jié)果顯示,ZF-RNase-1在該時期的表達豐度極低,僅在受精后24小時被特異性上調(diào);ZF-RNase-3/5在該時期的表達水平隨時間逐漸上升,提示ZF-RNase-1/3/5在斑馬魚胚胎發(fā)育早期可能扮演不同角色,且ZF-RNase-1很可能僅參與調(diào)控受精后24小時這一時間點的特定發(fā)育學過程。鑒于已報道的ZF-RNase-3在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和體外功能方面與hANG差異比較明顯,而在我們的初步探索中亦未發(fā)現(xiàn)其明顯的體內(nèi)功能(詳見討論6.1),我們將研究重點集中到ZF-RNase-1和5上。 原位雜交(in situ hybridization)結(jié)果顯示,ZF-RNase-1mRNA主要分布于原初腦和軀干腹側(cè)；ZF-RNase-5mRNA除了分布于以上組織區(qū)域外,還分布于卵黃囊四周。已知在斑馬魚胚胎發(fā)育早期,軀干腹側(cè)是主要血管——背主動脈(dorsal aorta, DA)和后主靜脈(posterior cardinal vein, PCV)所在的位置。因此,我們的結(jié)果明顯提示這兩個ANG同源基因可能參與對斑馬魚血管系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控,而ZF-RNase-5還可能與卵黃組織的形成或功能息息相關(guān)。為深入研究其功能,我們利用RACE (rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)獲得了ZF-RNase-1/5的全長cDNA。測序結(jié)果顯示,相比于NCBI數(shù)據(jù)庫中的對應(yīng)序列,本論文得到的ZF-RNase-1的cDNA缺失了整段信號肽序列,而ZF-RNase-5cDNA的5’UTR不僅在-1至-104位的序列一致性僅為46%,還在-104位之前多出約170個堿基,提示雖然ZF-RNase-1被歸為斑馬魚核糖核酸酶A超家族,但它可能并非作為傳統(tǒng)認為的分泌蛋白來發(fā)揮作用。 在此基礎(chǔ)上,我們利用能在斑馬魚胚胎中特異性下調(diào)特定基因表達的常用工具—-Morpholinos (Morpholino phosphorodiamidate antisense oligonucleotides, MOs)下調(diào)ZF-RNase-1/5的表達水平,期望通過對表達下調(diào)后的胚胎所表現(xiàn)出的缺陷表型研究,初步揭示它們在胚胎發(fā)育早期的不同階段、不同組織中所行使的功能。 首先,我們利用可實時觀察和研究斑馬魚血管新生的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg(flil:EGFP)y1來探索ZF-RNase-1在胚胎發(fā)育早期血管新生中的功能。我們將特異性靶向ZF-RNase-1的MOs注射入該轉(zhuǎn)基因斑馬魚的單細胞期受精卵的卵黃中,觀察并記錄受精后2天以內(nèi)的血管新生情況。結(jié)果顯示,ZF-RNase-1的MOs導(dǎo)致胚胎在受精后36小時表現(xiàn)顯著的體節(jié)間血管(intersegmental vessel, ISV)缺陷,即ISV未延伸至背側(cè)頂端并形成背側(cè)縱向吻合血管(dorsal longitudinal anastomotic vessel, DLAV);該表型能夠通過補入體外轉(zhuǎn)錄的ZF-RNase-1mRNA部分挽救。當我們僅注射ZF-RNase-1mRNA進行過表達時,胚胎表現(xiàn)出顯著的ISV異位生長現(xiàn)象,即ISV延伸至水平肌隔之上、尚未至背側(cè)頂端即提前分支,但最終卻在背側(cè)頂端形成正常的DLAV。進一步研究表明,ZF-RNase-1表達水平的改變導(dǎo)致了促血管新生的VEGF信號在血管內(nèi)皮細胞膜表面的受體分子——kdrl (kinase insert domain receptor like, VEGFR2)表達水平的相應(yīng)變化,而對抑制血管異位生長的Notch信號的配體分子——delta like ligand4(dll4)的表達水平無顯著影響。以上結(jié)果表明,ZF-RNase-1通過VEGF信號通路促進了胚胎發(fā)育早期血管新生過程中ISV的生長。 然后,我們研究了ZF-RNase-5在胚胎發(fā)育早期血管新生及其卵黃延伸體形成和形態(tài)維持上的作用。在Tg(fli1:EGFP)y1轉(zhuǎn)基因斑馬魚中下調(diào)ZF-RNase-5的表達后,胚胎發(fā)育早期血管新生中的ISV萌芽受到抑制；該表型能夠通過補入體外轉(zhuǎn)錄的ZF-RNase-5mRNA顯著挽救。此外,這些胚胎還表現(xiàn)出顯著的形態(tài)學特征——卵黃延伸體的缺陷。卵黃延伸體是從胚胎靠近頭部的球形卵黃囊向尾部延伸而形成的圓柱形腹側(cè)組織,主要為發(fā)育早期的胚胎軀干部提供營養(yǎng)物質(zhì)。為更直接地研究上述卵黃延伸體的缺陷表型,我們將特異性靶向ZF-RNase-5的MOs注射入AB品系野生型斑馬魚單細胞期受精卵的卵黃中,導(dǎo)致在受精后2-5天胚胎的孵化率和存活率顯著降低,提示ZF-RNase-5對早期胚胎發(fā)育是重要和必要的。在受精后24小時,這些胚胎依然表現(xiàn)出嚴重的卵黃延伸體缺陷,即卵黃延伸體顯著縮小甚至完全缺失；該表型亦能夠通過補入體外轉(zhuǎn)錄的ZF-RNase-5mRNA部分挽救。進一步,我們通過TUNEL實驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)ZF-RNase-5的表達誘導(dǎo)了胚胎卵黃合胞體層中特異性的DNA損傷。以上結(jié)果提示,ZF-RNase-5在卵黃延伸體的形成、維持及軀干間的營養(yǎng)物質(zhì)運輸和代謝扮演了關(guān)鍵性的角色。在檢測到抑制ZF-RNase-5的表達顯著上調(diào)胚胎體內(nèi)與DNA損傷及細胞凋亡密切相關(guān)的p53蛋白水平并激活下游基因p21和Bax表達的基礎(chǔ)上,我們利用p53基因操作和tp53基因DNA結(jié)合域突變的轉(zhuǎn)基因斑馬魚tp53M214K進行機制研究。結(jié)果顯示,當共注射特異性靶向ZF-RNase-5和p53的MOs后,上述卵黃延伸體的缺陷被顯著地部分挽救；抑制tp53M214K中ZF-RNase-5的表達未引起上述卵黃延伸體的缺陷。以上結(jié)果表明,下調(diào)ZF-RNase-5的表達不僅抑制了胚胎發(fā)育早期血管新生中ISV的萌芽,而且顯著上調(diào)了p53的蛋白水平,激活了p53信號通路,誘導(dǎo)了該時期卵黃合胞體層中特異性的DNA損傷,從而引起了嚴重的卵黃延伸體缺陷。 據(jù)最新報道,在人類胎盤發(fā)育過程中hANG不僅在蛻膜期的腺上皮細胞、母源血管細胞、巨噬細胞中顯著表達,還可由絨毛外滋養(yǎng)層細胞、絨毛滋養(yǎng)層(extravillous and villous cytotrophoblasts)細胞分泌。本論文結(jié)果證明ZF-RNase-5在卵黃組織(亦被稱為假胎盤,與人類胎盤的主要功能相似)中高表達并發(fā)揮了積極作用。因此,我們有理由推測hANG可能參與調(diào)控了人類胎盤正常形態(tài)或功能的維持。 綜上所述,本學位論文不僅構(gòu)建了hANG的同源基因——斑馬魚核糖核酸酶A超家族成員ZF-RNase-1和ZF-RNase-5在胚胎發(fā)育早期的時空表達譜,完成了其cDNA全長的測定,還初步揭示了它們在該時期的體內(nèi)生物學功能。其中,ZF-RNase-1通過VEGF信號通路促進了血管新生中ISV的生長；ZF-RNase-5不僅與血管新生中的ISV萌芽相關(guān),而且通過p53信號通路調(diào)控卵黃延伸體形態(tài)的維持。我們的研究結(jié)果表明,]hANG在體內(nèi)的生物學功能與血管新生和胚胎發(fā)育相關(guān)。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q954.4

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 尚云;劉玲;曹坤峰;王多德;王薇;許浩;;宮內(nèi)感染對早產(chǎn)新生大鼠腦發(fā)育的影響[J];中國當代兒科雜志;2010年07期

2 薛小寧;崔繼秀;張元平;;血管化組織工程骨構(gòu)建的研究進展[J];中國醫(yī)藥導(dǎo)刊;2009年05期

3 楊太成,冼江,楊傳紅,劉佳,夏冰,王捷,賴晃文,鄭文嶺;抗rhANG多克隆抗體的制備及初步應(yīng)用[J];廣東醫(yī)學;2003年08期

4 何振輝;腫瘤血管生成機制與抗腫瘤血管生成[J];國外醫(yī)學.臨床生物化學與檢驗學分冊;2004年01期

5 李茶果;肖踐明;;急性心肌梗死多種治療方法的研究進展[J];臨床醫(yī)學;2013年05期

6 舒靜;田文琳;李林;劉玉林;陳俊霞;;下調(diào)血管生成素對人膀胱癌T24細胞增殖、凋亡的影響[J];第三軍醫(yī)大學學報;2014年14期

7 肖詩藝;王莉;陳仁典;吳進;張越驪;何莉;;Slit3/Robo4在大鼠角膜新生血管中的表達[J];國際眼科雜志;2014年07期

8 Carlotta Montagnoli;Larciprete Giovanni;;Preeclampsia: Definitions, screening tools and diagnostic criteria in the supersonic era[J];World Journal of Obstetrics and Gynecology;2014年03期

9 翁丹;尹國武;朱曉明;;血管生成素與妊娠[J];國際婦產(chǎn)科學雜志;2015年02期

10 何海燕;陳子林;;康柏西普治療老年性黃斑變性的研究現(xiàn)狀[J];國際眼科雜志;2015年08期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳立瑾;田利源;李秀麗;汪莉;王玉民;陳樹林;;小鼠附睪分泌蛋白Fam12b的原核表達純化[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物解剖學及組織胚胎學分會第十六次學術(shù)研討會論文集[C];2010年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 翁春華;血管生成素特異microRNAs的鑒定與功能分析[D];浙江大學;2010年

2 趙佳;血管生成素負調(diào)節(jié)堿性成纖維生長因子的機制及對腫瘤細胞的影響[D];東北師范大學;2011年

3 李學農(nóng);大腸癌HGF/SF-met信號通路轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)基因表達譜及阻斷作用研究[D];第一軍醫(yī)大學;2002年

4 趙志成;肝癌血管生成機理探討及EGCG抑制血管生成的實驗研究[D];浙江大學;2004年

5 鄧輝;光化學療法、全反式維甲酸及當歸的體外抗血管新生作用研究[D];復(fù)旦大學;2004年

6 李英輝;靶向核糖核酸酶抗乙肝病毒作用的研究和抗乙肝病毒機制的初步探索[D];第四軍醫(yī)大學;2005年

7 宋金娜;血管生成素對黑色素瘤細胞生長及對堿性成纖維生長因子表達的影響[D];東北師范大學;2006年

8 錢志遠;組織微陣列技術(shù)在SV40與人膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)性研究中的應(yīng)用[D];蘇州大學;2005年

9 曹建國;血管基膜衍生多功能肽治療腫瘤主要藥效學及信號蛋白磷酸化比較研究[D];中南大學;2006年

10 曾濤;腦動靜脈畸形臨床病理與血管平滑肌細胞的相關(guān)生物學研究[D];復(fù)旦大學;2005年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 范春水;法舒地爾對VEGF誘導(dǎo)的大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖的抑制作用研究[D];山西醫(yī)科大學;2011年

2 曲來強;HIF-1和SDF-1在大鼠缺血再灌注視網(wǎng)膜中的表達及其意義[D];蘭州大學;2011年

3 許丹;消癌平注射液及其與奧沙利鉑和重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合抗肝癌血管生成的實驗研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2011年

4 楊梅;江豚核基因內(nèi)元的遺傳變異及鯨類RNASE1基因的適應(yīng)性進化研究[D];南京師范大學;2011年

5 魏建敏;血管生成在胃腸道惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究[D];寧夏醫(yī)科大學;2010年

6 阮永樂;大鼠到小鼠異種胰島移植模型建立及其免疫學特點研究[D];華中科技大學;2010年

7 王瑩;胎盤血管疾病患者臍靜脈血內(nèi)皮祖細胞數(shù)量的變化[D];華中科技大學;2011年

8 唐麗君;類表皮生長因子域7在高氧致新生大鼠新型支氣管肺發(fā)育不良中的表達及意義[D];南方醫(yī)科大學;2011年

9 廖永強;CD105與VEGF在大腸癌組織中的表達及意義[D];青島大學;2002年

10 陳瑜;Angiogenin表達在胃癌血管生成中的作用[D];福建醫(yī)科大學;2003年

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本文編號：1267686