本文關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú)核糖核酸酶1和5在胚胎發(fā)育早期的功能研究

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【摘要】：斑馬魚(yú)(zebrafish, Danio rerio)核糖核酸酶A超家族(RNase A superfamily)由Elio Pizzo等于2006年首次發(fā)現(xiàn)。迄今為止已報(bào)道的成員一共有5名,分別被命名為zebrafish RNase1/2/3/4/5(ZF-RNase-1/2/3/4/5)。作為人類(lèi)血管生成素(human angiogenin, hANG)的同源基因,它們與hANG在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞水平功能學(xué)方面有相當(dāng)高的相似程度�？紤]到小鼠體內(nèi)存在6個(gè)hANG同源基因和3個(gè)假基因,進(jìn)行hANG功能學(xué)研究較為復(fù)雜,我們擬用斑馬魚(yú)作為體內(nèi)功能研究的動(dòng)物模型。為此,本論文在初略探明斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育早期ZF-RNases表達(dá)情況的基礎(chǔ)上,對(duì)2個(gè)在該時(shí)期顯著表達(dá)的成員——ZF-RNase-1和5進(jìn)行了深入研究,不僅構(gòu)建了兩者的時(shí)空表達(dá)模式,還探索了它們?cè)谠摃r(shí)期的體內(nèi)生物學(xué)功能。 首先,我們從AB品系野生型斑馬魚(yú)整胚的cDNA中克隆得到ZF-RNases的表達(dá)序列(expressed sequence tags, ESTs),利用半定量PCR(semi-quantitative reverse transcription and PCR, semi-quantitative RT-PCR)的方法明確了5名成員中僅ZF-RNase-1/3/5在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育早期顯著表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,我們利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR, qRT-PCR)技術(shù)研究了ZF-RNase-1/3/5在受精后0-72小時(shí)的時(shí)間表達(dá)譜。結(jié)果顯示,ZF-RNase-1在該時(shí)期的表達(dá)豐度極低,僅在受精后24小時(shí)被特異性上調(diào);ZF-RNase-3/5在該時(shí)期的表達(dá)水平隨時(shí)間逐漸上升,提示ZF-RNase-1/3/5在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育早期可能扮演不同角色,且ZF-RNase-1很可能僅參與調(diào)控受精后24小時(shí)這一時(shí)間點(diǎn)的特定發(fā)育學(xué)過(guò)程。鑒于已報(bào)道的ZF-RNase-3在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和體外功能方面與hANG差異比較明顯,而在我們的初步探索中亦未發(fā)現(xiàn)其明顯的體內(nèi)功能(詳見(jiàn)討論6.1),我們將研究重點(diǎn)集中到ZF-RNase-1和5上。 原位雜交(in situ hybridization)結(jié)果顯示,ZF-RNase-1mRNA主要分布于原初腦和軀干腹側(cè)；ZF-RNase-5mRNA除了分布于以上組織區(qū)域外,還分布于卵黃囊四周。已知在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育早期,軀干腹側(cè)是主要血管——背主動(dòng)脈(dorsal aorta, DA)和后主靜脈(posterior cardinal vein, PCV)所在的位置。因此,我們的結(jié)果明顯提示這兩個(gè)ANG同源基因可能參與對(duì)斑馬魚(yú)血管系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控,而ZF-RNase-5還可能與卵黃組織的形成或功能息息相關(guān)。為深入研究其功能,我們利用RACE (rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)獲得了ZF-RNase-1/5的全長(zhǎng)cDNA。測(cè)序結(jié)果顯示,相比于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的對(duì)應(yīng)序列,本論文得到的ZF-RNase-1的cDNA缺失了整段信號(hào)肽序列,而ZF-RNase-5cDNA的5’UTR不僅在-1至-104位的序列一致性?xún)H為46%,還在-104位之前多出約170個(gè)堿基,提示雖然ZF-RNase-1被歸為斑馬魚(yú)核糖核酸酶A超家族,但它可能并非作為傳統(tǒng)認(rèn)為的分泌蛋白來(lái)發(fā)揮作用。 在此基礎(chǔ)上,我們利用能在斑馬魚(yú)胚胎中特異性下調(diào)特定基因表達(dá)的常用工具—-Morpholinos (Morpholino phosphorodiamidate antisense oligonucleotides, MOs)下調(diào)ZF-RNase-1/5的表達(dá)水平,期望通過(guò)對(duì)表達(dá)下調(diào)后的胚胎所表現(xiàn)出的缺陷表型研究,初步揭示它們?cè)谂咛グl(fā)育早期的不同階段、不同組織中所行使的功能。 首先,我們利用可實(shí)時(shí)觀察和研究斑馬魚(yú)血管新生的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系Tg(flil:EGFP)y1來(lái)探索ZF-RNase-1在胚胎發(fā)育早期血管新生中的功能。我們將特異性靶向ZF-RNase-1的MOs注射入該轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的單細(xì)胞期受精卵的卵黃中,觀察并記錄受精后2天以?xún)?nèi)的血管新生情況。結(jié)果顯示,ZF-RNase-1的MOs導(dǎo)致胚胎在受精后36小時(shí)表現(xiàn)顯著的體節(jié)間血管(intersegmental vessel, ISV)缺陷,即ISV未延伸至背側(cè)頂端并形成背側(cè)縱向吻合血管(dorsal longitudinal anastomotic vessel, DLAV);該表型能夠通過(guò)補(bǔ)入體外轉(zhuǎn)錄的ZF-RNase-1mRNA部分挽救。當(dāng)我們僅注射ZF-RNase-1mRNA進(jìn)行過(guò)表達(dá)時(shí),胚胎表現(xiàn)出顯著的ISV異位生長(zhǎng)現(xiàn)象,即ISV延伸至水平肌隔之上、尚未至背側(cè)頂端即提前分支,但最終卻在背側(cè)頂端形成正常的DLAV。進(jìn)一步研究表明,ZF-RNase-1表達(dá)水平的改變導(dǎo)致了促血管新生的VEGF信號(hào)在血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的受體分子——kdrl (kinase insert domain receptor like, VEGFR2)表達(dá)水平的相應(yīng)變化,而對(duì)抑制血管異位生長(zhǎng)的Notch信號(hào)的配體分子——delta like ligand4(dll4)的表達(dá)水平無(wú)顯著影響。以上結(jié)果表明,ZF-RNase-1通過(guò)VEGF信號(hào)通路促進(jìn)了胚胎發(fā)育早期血管新生過(guò)程中ISV的生長(zhǎng)。 然后,我們研究了ZF-RNase-5在胚胎發(fā)育早期血管新生及其卵黃延伸體形成和形態(tài)維持上的作用。在Tg(fli1:EGFP)y1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中下調(diào)ZF-RNase-5的表達(dá)后,胚胎發(fā)育早期血管新生中的ISV萌芽受到抑制；該表型能夠通過(guò)補(bǔ)入體外轉(zhuǎn)錄的ZF-RNase-5mRNA顯著挽救。此外,這些胚胎還表現(xiàn)出顯著的形態(tài)學(xué)特征——卵黃延伸體的缺陷。卵黃延伸體是從胚胎靠近頭部的球形卵黃囊向尾部延伸而形成的圓柱形腹側(cè)組織,主要為發(fā)育早期的胚胎軀干部提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。為更直接地研究上述卵黃延伸體的缺陷表型,我們將特異性靶向ZF-RNase-5的MOs注射入AB品系野生型斑馬魚(yú)單細(xì)胞期受精卵的卵黃中,導(dǎo)致在受精后2-5天胚胎的孵化率和存活率顯著降低,提示ZF-RNase-5對(duì)早期胚胎發(fā)育是重要和必要的。在受精后24小時(shí),這些胚胎依然表現(xiàn)出嚴(yán)重的卵黃延伸體缺陷,即卵黃延伸體顯著縮小甚至完全缺失；該表型亦能夠通過(guò)補(bǔ)入體外轉(zhuǎn)錄的ZF-RNase-5mRNA部分挽救。進(jìn)一步,我們通過(guò)TUNEL實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下調(diào)ZF-RNase-5的表達(dá)誘導(dǎo)了胚胎卵黃合胞體層中特異性的DNA損傷。以上結(jié)果提示,ZF-RNase-5在卵黃延伸體的形成、維持及軀干間的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸和代謝扮演了關(guān)鍵性的角色。在檢測(cè)到抑制ZF-RNase-5的表達(dá)顯著上調(diào)胚胎體內(nèi)與DNA損傷及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的p53蛋白水平并激活下游基因p21和Bax表達(dá)的基礎(chǔ)上,我們利用p53基因操作和tp53基因DNA結(jié)合域突變的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)tp53M214K進(jìn)行機(jī)制研究。結(jié)果顯示,當(dāng)共注射特異性靶向ZF-RNase-5和p53的MOs后,上述卵黃延伸體的缺陷被顯著地部分挽救；抑制tp53M214K中ZF-RNase-5的表達(dá)未引起上述卵黃延伸體的缺陷。以上結(jié)果表明,下調(diào)ZF-RNase-5的表達(dá)不僅抑制了胚胎發(fā)育早期血管新生中ISV的萌芽,而且顯著上調(diào)了p53的蛋白水平,激活了p53信號(hào)通路,誘導(dǎo)了該時(shí)期卵黃合胞體層中特異性的DNA損傷,從而引起了嚴(yán)重的卵黃延伸體缺陷。 據(jù)最新報(bào)道,在人類(lèi)胎盤(pán)發(fā)育過(guò)程中hANG不僅在蛻膜期的腺上皮細(xì)胞、母源血管細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中顯著表達(dá),還可由絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞、絨毛滋養(yǎng)層(extravillous and villous cytotrophoblasts)細(xì)胞分泌。本論文結(jié)果證明ZF-RNase-5在卵黃組織(亦被稱(chēng)為假胎盤(pán),與人類(lèi)胎盤(pán)的主要功能相似)中高表達(dá)并發(fā)揮了積極作用。因此,我們有理由推測(cè)hANG可能參與調(diào)控了人類(lèi)胎盤(pán)正常形態(tài)或功能的維持。 綜上所述,本學(xué)位論文不僅構(gòu)建了hANG的同源基因——斑馬魚(yú)核糖核酸酶A超家族成員ZF-RNase-1和ZF-RNase-5在胚胎發(fā)育早期的時(shí)空表達(dá)譜,完成了其cDNA全長(zhǎng)的測(cè)定,還初步揭示了它們?cè)谠摃r(shí)期的體內(nèi)生物學(xué)功能。其中,ZF-RNase-1通過(guò)VEGF信號(hào)通路促進(jìn)了血管新生中ISV的生長(zhǎng)；ZF-RNase-5不僅與血管新生中的ISV萌芽相關(guān),而且通過(guò)p53信號(hào)通路調(diào)控卵黃延伸體形態(tài)的維持。我們的研究結(jié)果表明,]hANG在體內(nèi)的生物學(xué)功能與血管新生和胚胎發(fā)育相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：Q954.4

【共引文獻(xiàn)】

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