本文關(guān)鍵詞：LGL1基因在小鼠嗅球發(fā)育中的功能研究

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【摘要】：擬解決的科學(xué)問題本試驗利用小鼠的條件性基因敲除技術(shù),獲得LGL1嗅球特異性敲除小鼠,即Pax2-LGL1條件敲除小鼠。利用這一條件性敲除的小鼠動物模型,我們研究了LGL1基因在嗅球發(fā)育過程中的重要生物學(xué)功能及對嗅覺信號傳導(dǎo)的可能影響機制。擬解決的科學(xué)問題為：(1)LGL1在小鼠嗅球發(fā)育中的作用；(2)LGL1影響嗅覺信息傳導(dǎo)的可能機制； (3)LGL1在調(diào)節(jié)嗅球神經(jīng)元遷移和定位的可能分子機制。研究方案及取得的成果本論文為了解決上述科學(xué)問題,以小鼠為實驗材料,利用Cre-LoxP系統(tǒng),首先制作了在嗅球中特異性敲除LGL1基因的小鼠模型,由于More-Cre介導(dǎo)的LGL1基因敲除小鼠在出生后24時致死,因此,我們采用Pax2-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠在小鼠嗅球中特異性敲除LGL1,所得到的Pax2-LGL1條件敲除小鼠可成功存活至成體。在本論文中,我們利用Pax2-LGL1條件敲除小鼠研究了LGL1基因組嗅球發(fā)育過程中的重要作用。Pax2-Cre表達時間較早,大約在胚胎期E7.5天時將LGL1基因在嗅球中特異性敲除。在研究中,我們發(fā)現(xiàn),LGL1基因條件敲除小鼠可以存活到成體,但同野生型小鼠相比,LGL1基因敲除的純合型小鼠在個體大小和嗅球形態(tài)上存在明顯的發(fā)育異常。Pax2-LGL1條件敲除小鼠體型和嗅球均較小,且存在水腫現(xiàn)象。對野生型和純合型小鼠的體重跟蹤稱量發(fā)現(xiàn),與野生型小鼠相比,純合型小鼠的體重明顯減輕。同時,對嗅球背部表面積的測量表明,純合型小鼠的嗅球表面積明顯變小。為了研究LGL1基因敲除對小鼠嗅覺功能的影響,我們分別采用了經(jīng)典的行為學(xué)試驗“食物包埋試驗”和“嗅迷宮試驗”對小鼠的嗅覺功能進行了檢測。試驗結(jié)果表明在“食物包埋試驗”和“嗅迷宮試驗”中,純合型小鼠尋找食物所用的時間明顯大于野生型小鼠。這也揭示LGL1在小鼠嗅球中的特異性敲除不僅影響了小鼠體型和嗅球形態(tài)的正常發(fā)育,同時也對小鼠嗅功能的正常發(fā)揮產(chǎn)生了重要的影響。小鼠嗅球結(jié)構(gòu)在進化上具有高度保守的層狀結(jié)構(gòu),我們進一步對嗅球的形態(tài)結(jié)構(gòu)進行了分析,結(jié)果顯示,.在野生型小鼠發(fā)育過程中,嗅球的層狀結(jié)構(gòu)清晰,各層神經(jīng)元排列穩(wěn)定有序,而在Pax2-LGL1條件敲除的純合型小鼠發(fā)育過程中,嗅球?qū)訝罱Y(jié)構(gòu)模糊,神經(jīng)元排列紊亂,并在嗅周球細胞層和僧帽狀細胞層中出現(xiàn)了層狀結(jié)構(gòu)異常以及神經(jīng)元缺失的現(xiàn)象。因此,我們提出在小鼠嗅球發(fā)育的過程中,LGL1基因?qū)π∈笮崆蛘訝罱Y(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定,神經(jīng)元的定位和分布起重要作用。雖然小鼠嗅球結(jié)構(gòu)在進化上具有高度保守的層狀結(jié)構(gòu),但是各層狀結(jié)構(gòu)的特征性神經(jīng)元卻并不完全相同,所以可以利用不同的神經(jīng)元標記分子對嗅球中各層中的特征性神經(jīng)元進行標記、觀察。我們首先研究了LGL1基因缺失對SP8標記的中間神經(jīng)元的影響。轉(zhuǎn)錄因子SP8是SP1鋅指蛋白家族成員,在小鼠嗅球的多巴胺能/非多巴胺能和鈣網(wǎng)膜蛋白中間神經(jīng)元都能夠表達。SP8的免疫熒光標記結(jié)果顯示,在成熟的小鼠嗅球中,野生型小鼠嗅周球細胞層中SP8陽性中間神經(jīng)元排列緊密有序,但在Pax2-LGL1條件敲除的純合型小鼠中,SP8陽性中間神經(jīng)元排列紊亂甚至缺失。然而進一步的Western blotting結(jié)果顯示,LGL1條件敲除的純合型小鼠中嗅球中SP8的表達水平并沒有出現(xiàn)明顯的下降。這一結(jié)果說明,LGL1缺失可能并沒有導(dǎo)致嗅球中SP8陽性中間神經(jīng)元數(shù)量的明顯下降,但在引導(dǎo)SP8陽性中間神經(jīng)元的定位和分布中起重要作用。接下來我們對中間神經(jīng)元的亞型鈣結(jié)合蛋白中間神經(jīng)元進行了檢測。通過Calbidin D28k的免疫熒光染色顯示,同野生型小鼠相比,純合型小鼠鈣結(jié)合蛋白陽性中間神經(jīng)元層明顯變窄,排列紊亂并且數(shù)目減少,表達水平降低。嗅球僧帽狀細胞是調(diào)控嗅覺信號向大腦傳導(dǎo)的刺激和選擇特異性的重要神經(jīng)元,同時也是副嗅球(accessory olfactory bulb, AOB)的主要功能性神經(jīng)元之一。在試驗中我們研究了Tbx21標記的位于僧帽狀細胞層的特征性紋狀神經(jīng)元僧帽細胞(mitral cells, MCs)。通過Tbx21的免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),在小鼠嗅球發(fā)育過程中,相比于野生型小鼠的嗅球,純合型小鼠嗅球的僧帽狀細胞層寬度明顯變小,其中的MCs紋狀神經(jīng)元隨著嗅球的發(fā)育成熟,逐漸變少,排列紊亂。并且對AOB的檢測發(fā)現(xiàn),純合型小鼠的AOB明顯變小,MCs紋狀神經(jīng)元數(shù)目同樣明顯減少。本課題中我們主要研究了在LGL1在嗅球小鼠嗅球形成和發(fā)育過程中,對其發(fā)育調(diào)控的重要功能及可能的分子機制。嗅球是生物體認知的重要功能性器官,也是神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分,參與更高水平的功能,包括情感,種群信息交流以及運動協(xié)調(diào)等能力。在本論文中,我們首先采用了經(jīng)典的嗅覺檢測的行為學(xué)實驗,包括食物包埋試驗和嗅迷宮試驗,檢測了Pax2-LGL1條件敲除小鼠的嗅覺變化情況。結(jié)果顯示Pax2-LGL1條件敲除小鼠的尋找食物能力明顯下降。與成熟的野生型小鼠嗅球相比,Pax2-LGL1條件敲除小鼠的體型和嗅球明顯減小,并出現(xiàn)了輕微的水腫現(xiàn)象,嗅球中的中間神經(jīng)元和紋狀神經(jīng)元的發(fā)育明顯出現(xiàn)異常,神經(jīng)元分布紊亂,表達水平降低。研究意義本論文利用LGL1特異性敲除小鼠模型,闡明了LGL1基因在小鼠嗅球形成和發(fā)育過程中的重要功能,從細胞水平和分子水平上揭示了LGL1調(diào)節(jié)嗅球發(fā)育和神經(jīng)元遷移的可能機制,為進一步研究高等動物的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育提供了理論基礎(chǔ)。此外,神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,尤其AD隨著社會人口老齡化程度的加劇,越來越常見,并且在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域還沒有找到真正的病因和治愈方法。由于嗅覺障礙被發(fā)現(xiàn)作為AD患者初期的臨床主要癥狀之一,因此,對嗅球發(fā)育及嗅覺信號傳導(dǎo)的研究能夠在一定程度上推動了諸如AD等神經(jīng)性疾病臨床診斷治療的發(fā)展。本研究制作的Pax2-LGL1條件敲除小鼠可以存活至成體,并作為理想的人類疾病的動物模型,不僅為臨床診斷和治療提供理論基礎(chǔ),同樣可以為高等動物認知障礙和嗅覺相關(guān)疾病的治療提供新的思路,具有一定的指導(dǎo)意義。我們可以從神經(jīng)性疾病患者中,特別是AD病人中檢測是否存在LGL1基因的突變,可能為以后藥物靶向位點的設(shè)計和神經(jīng)相關(guān)性疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。因此,我們的研究成果不僅為嗅球發(fā)育的基礎(chǔ)研究填補了一定的空白,同時也在一定程度上推動了嗅功能障礙及相關(guān)的神經(jīng)性疾病臨床診斷治療的發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78

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1 檀進發(fā),張德興,柯銘華;大鼠嗅球傳入聯(lián)系的起源[J];解剖學(xué)雜志;1991年01期

2 趙君朋,王珂,楊磊,雷季良;嗅成鞘細胞在新生大鼠嗅球的分布[J];解剖學(xué)雜志;2005年02期

3 張敬虎，，李永材;切除嗅球?qū)?

本文編號：1263597