本文關(guān)鍵詞：用于禽流感病毒快速檢測的納米磁珠分離器研究

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【摘要】：近年來,納米技術(shù)的發(fā)展為生物學(xué)研究提供了新的手段和機(jī)遇,在生物物質(zhì)的富集和分離研究中,納米免疫磁珠分離技術(shù)顯示出巨大的應(yīng)用前景。納米免疫磁珠分離技術(shù)能夠有效排除分析樣品中的背景干擾,實(shí)現(xiàn)樣品的純化和富集。其基本原理是在磁珠表面引入功能基團(tuán),將特異性抗體結(jié)合在磁珠上,使之與樣品中的目標(biāo)分析物發(fā)生免疫反應(yīng),形成磁珠-抗體-抗原復(fù)合物。這種復(fù)合物在外加磁場作用下做定向移動,最終被吸附并滯留在磁場中,從而將具有相應(yīng)抗原表位的目標(biāo)物與其它物質(zhì)進(jìn)行分離,達(dá)到提取、純化和濃縮目標(biāo)分析物的目的。將該技術(shù)與叉指微電極阻抗免疫傳感器聯(lián)用可顯著提高檢測系統(tǒng)的靈敏度并進(jìn)行快速檢測。本文研究的背景是禽流感病毒快速檢測技術(shù),重點(diǎn)研究了禽流感病毒快速檢測平臺中用于禽流感病毒樣本采集和前處理的永磁體納米磁珠分離器設(shè)計(jì)及相關(guān)試驗(yàn)。理論分析和前人研究表明:對于磁珠粒徑小、材料磁化率低、流體介質(zhì)粘度大的體系,免疫磁珠較難分離,要求免疫磁珠分離器應(yīng)具備強(qiáng)磁場高梯度特征;為了實(shí)現(xiàn)便攜,磁珠分離器的小型化也顯得十分必要。在納米磁珠分離器結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)方面,通過分析仿真常用的永磁體磁珠分離器,提出了環(huán)形六孔納米磁珠分離器結(jié)構(gòu),采用特制的瓦型釹鐵硼永磁體同性磁極緊貼互斥以增強(qiáng)磁場強(qiáng)度的原理,用六塊外磁瓦(大)和六塊內(nèi)磁瓦(小)磁極同性互斥擺放,磁極中間放置坡莫合金導(dǎo)磁片聚集和傳導(dǎo)磁場,從而形成六個強(qiáng)磁場高梯度試管分離區(qū)域。磁珠分離器采用弱順磁金屬鋁合金制作圓柱形外殼固定磁體,形成緊湊結(jié)構(gòu)。研究中,通過改變磁珠分離器體積、導(dǎo)磁片材料、導(dǎo)磁片形狀等不同設(shè)計(jì)要素設(shè)計(jì)制作了四套磁珠分離器并對各自六個分離試管孔的磁場強(qiáng)度和磁場梯度進(jìn)行了測試分析,所設(shè)計(jì)的磁珠分離器(體積865.5cm3,重4.8kg)最高磁場強(qiáng)度實(shí)測1.44T,最高磁場梯度實(shí)測96.3T/m;四套磁珠分離器裝置各自孔間平均相對誤差均在2.0%-3.3%之間,可認(rèn)為同一磁珠分離器上六個磁分離孔的分離效果相同。研究結(jié)果表明:磁珠分離器體積、導(dǎo)磁片材料和形狀等因素對磁珠分離器磁場強(qiáng)度和梯度均有不同程度的影響,大體積較小體積磁珠分離器、坡莫合金較軟鐵導(dǎo)磁片、斜壁較直壁形狀坡莫合金導(dǎo)磁片均能實(shí)現(xiàn)較大的磁場強(qiáng)度和梯度,可以根據(jù)不同應(yīng)用需求,組合相關(guān)要素以獲得理想的免疫磁珠分離器。在納米磁珠分離器分離效率的研究方面,本文采用小體積的磁珠分離器(最高磁場強(qiáng)度1.26T;最大磁場梯度84.4T/m;體積401.3cm3;重量2.2kg)進(jìn)行了磁珠分離器磁珠分離效率的定性和定量研究。在通過目測、透射電鏡、Dot-ELISA驗(yàn)證等方法定性考核150nm免疫磁珠分離滅活禽流感病毒H5N1的基礎(chǔ)上,采用30nm、100nm和180nm免疫磁珠分離大腸桿菌,并采用平板菌落計(jì)數(shù)法對納米磁珠分離器的分離效率進(jìn)行了定量評估,從分離時(shí)長、分離穩(wěn)定性和分離靈敏度等三方面對磁珠分離器分離效率的影響開展了相關(guān)試驗(yàn)研究,最后在禽流感快速檢測平臺聯(lián)合試驗(yàn)中采用180nm磁珠分離禽流感H5N1活病毒與熒光定量RT-PCR技術(shù)相結(jié)合的方法,定量考核了磁珠分離器對禽流感活病毒的磁珠分離效率。定性考核150nm免疫磁珠分離滅活禽流感H5N1病毒的結(jié)果表明:在1min之內(nèi),磁珠結(jié)合物在該分離器上已被徹底分離;以大腸桿菌.Ecoli O157:H7與180nm、100nm和30nm磁珠結(jié)合物為研究對象,采用平板菌落數(shù)計(jì)數(shù)方法統(tǒng)計(jì)的結(jié)果表明:當(dāng)分離時(shí)間分別大于等于40s、60s和60min時(shí),磁珠分離器對三種磁珠的捕獲效率均在96.5%以上,且磁珠分離后的上清液中沒有細(xì)菌殘留;對高濃度(610 CFU/m L)和低濃度(210 CFU/m L)的大腸桿菌,180nm、100nm和30nm磁珠的捕獲效率分別在96.5%~106.9%、99.7%~114.6%和98.5%~112.6%之間,對于濃度為103CFU/mL的.Ecoli O157:H7,三種免疫磁珠20個平行樣品的測試相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.84%~1.4%之間,說明磁珠分離器對三種磁珠分離的靈敏度和穩(wěn)定性良好。在禽流感病毒快速檢測平臺聯(lián)合試驗(yàn)中,定量考核180nm免疫磁珠分離禽流感H5N1活病毒的結(jié)果顯示:通過注入阻抗生物芯片的阻抗變化確定的最佳磁珠分離反應(yīng)時(shí)間為2min,通過熒光定量RT-PCR技術(shù)判定:在試驗(yàn)條件下,該磁珠分離器對102-104EID50/mL的H5N1禽流感病毒的平均捕效率為47.8%?3.2%,說明流感病毒抗體和抗原的匹配性和特異性也直接影響磁珠的分離效率。綜上,磁分離器效率的研究表明:所設(shè)計(jì)的納米磁珠分離器在微米量級的細(xì)菌和納米量級的病毒等微生物檢測中具有良好的應(yīng)用前景,為禽流感檢測平臺的快速性建立奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1262657