發(fā)布時間：2017-12-07 02:15

  本文關鍵詞：芽孢桿菌遺傳操作體系初建及工程菌株分子改良

  更多相關文章： 芽孢桿菌 遺傳操作體系 優(yōu)化 中性蛋白酶 發(fā)酵

【摘要】：芽孢桿菌(Bacillus)是革蘭氏陽性菌,不含內(nèi)毒素,能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分泌到胞外,是多種重要工業(yè)酶的生產(chǎn)菌株。隨著分子生物學和基因工程的迅速發(fā)展,芽孢桿菌作為基因表達系統(tǒng)得以不斷完善,并展現(xiàn)出良好的應用前景。本研究旨在建立和優(yōu)化枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)表達系統(tǒng),對工業(yè)用野生型芽孢桿菌的遺傳操作系統(tǒng)進行改良,以進一步提高工程菌株的表達量,并建立具有應用潛力的芽孢桿菌高效表達體系。本文首先對枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)載體進行建立及優(yōu)化,其中包括含有不同啟動子的表達載體(如:組成型啟動子P43、乳糖誘導型啟動子Pgrac、木糖誘導型啟動子Pxyl、淀粉酶啟動子PamyQ)、含有不同篩選標記的克隆載體(如:卡那霉素Kan、紅霉素Em、氯霉素Cm、四環(huán)素Tet)、以及含不同整合位點的整合載體的構建;其次對枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法進行優(yōu)化,有效的提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率,從而建立了一套完善的枯草芽孢桿菌表達技術,為外源基因的高效分泌和表達提供平臺。利用該表達體系,實現(xiàn)了氨肽酶基因lapB在枯草芽孢桿菌中的高效表達,其搖瓶水平上的酶活達到了58.8 U/mL。通過菌種改良獲得了能夠進行內(nèi)源性BamHI甲基化修飾的枯草芽孢桿菌菌株,通過對轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的甲基化修飾,以及感受態(tài)制備條件的摸索,建立了中溫α-淀粉酶工業(yè)生產(chǎn)菌株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens BF.7658的遺傳轉(zhuǎn)化方法。以該高效分泌淀粉酶的菌株為宿主菌,實現(xiàn)了堿性蛋白酶基因的高效異源分泌表達,重組解淀粉芽孢桿菌工程菌株AprEA在搖瓶培養(yǎng)72小時的分泌表達水平可達7800 U/mL,具有較好的應用潛力。解淀粉芽孢桿菌K11是本研究室保存的一株能高效分泌中性蛋白酶的野生型菌株,在搖瓶水平上其中性蛋白酶分泌水平可達到2700 U/mL。為進一步提高其中性蛋白酶的表達水平,本研究克隆了解淀粉芽孢桿菌K11的中性蛋白酶基因K11npr,并構建了游離型表達載體pKan300-K11npr和pUB110-K11npr。將多拷貝的游離型重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化K11菌株后獲得解淀粉芽孢桿菌重組菌F20和110N-6。重組菌F20和110N-6在牛奶初篩平板上的蛋白酶活性明顯要高于野生型菌株K11。通過發(fā)酵條件優(yōu)化,重組菌110N-6在搖瓶水平上的酶活力可達到8995 U/mL,比野生型菌株提高了2倍多,在15升發(fā)酵罐的酶活力可達到24,000-28,000 U/mL,是目前已報道表達水平最高的中性蛋白酶。重組表達質(zhì)粒的不穩(wěn)定性很大程度上限制了含高拷貝游離質(zhì)粒的重組芽孢桿菌的廣泛應用。本研究所構建的兩個游離型表達載體pKan300-K11npr和pUB110-K11npr,其最大的差異是前者含有能在大腸桿菌中復制的pBR322-ori復制元件,而后者中只含有芽孢桿菌復制元件。對重組菌的遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果表明:重組菌F20的遺傳穩(wěn)定性遠遠不如重組菌110N-6,在無選擇壓力的培養(yǎng)基上連續(xù)傳代,重組菌F20傳至第八代后質(zhì)粒即全部丟失,而重組菌110N-6傳至一百代,質(zhì)粒穩(wěn)定性仍保持在90%以上。推測表達載體中同時含有兩種不同的復制元件可能是質(zhì)粒在芽孢桿菌中不穩(wěn)定的重要原因之一。本研究所構建的重組質(zhì)粒pUB110-K11npr在菌株110N-6中非常穩(wěn)定,可以滿足工業(yè)化大生產(chǎn)要求。枯草芽孢菌株AS.1398是經(jīng)過長期誘變獲得的表達中性蛋白酶的商業(yè)菌株。通過研究不同濃度的氨芐青霉素對菌株細胞壁合成的抑制作用,建立了AS.1398菌株的遺傳轉(zhuǎn)化方法。將重組表達載體pUB110-K11npr導入AS.1398菌株中獲得的解淀粉芽孢桿菌重組菌,其中性蛋白酶的分泌能力比AS.1398菌株的酶活力提高一倍,在搖瓶水平上其酶活力可達到9295 U/mL。本研究從多個方面對枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)進行了優(yōu)化,并嘗試了多種野生型芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化條件,成功建立了針對野生型芽孢桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系,同時解決了芽孢桿菌中重組質(zhì)粒不穩(wěn)定的難題,為工業(yè)菌株發(fā)展成為新的基因工程表達體系提供新的思路。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q933

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 錢萍,沈海麗,張璐,谷海先;提高AS1.398中性蛋白酶發(fā)酵水平的研究[J];江蘇食品與發(fā)酵;2005年02期

，

本文編號：1260799