本文關(guān)鍵詞：Spt4:Spt5結(jié)合DNA以及抗體E9結(jié)合ErbB2的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究

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【摘要】：基因表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜并且受到多重調(diào)控的精細(xì)過(guò)程,包括了轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾三個(gè)過(guò)程,并受到多種蛋白質(zhì)復(fù)合物的調(diào)控�；虮磉_(dá)的第一步是轉(zhuǎn)錄,由RNA聚合酶催化,將遺傳信息從DNA傳遞到RNA。調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)被稱作轉(zhuǎn)錄因子,轉(zhuǎn)錄因子在原核、古核、真核三界中的保守程度并不高,但唯一例外的是Spt5/NusG家族。Spt5(原核中被稱作NusG)是唯一在三界中都存在的轉(zhuǎn)錄因子。在古核和真核生物中,Spt5可以和Spt4形成穩(wěn)定的異二聚體發(fā)揮功能；但在原核生物中并不存在Spt4的同源蛋白,因而NusG獨(dú)自發(fā)揮功能。前人的工作已經(jīng)證明,Spt4:Spt5復(fù)合物與RNA聚合酶直接相互作用,并結(jié)合在RNA聚合酶clamp結(jié)構(gòu)域的coiled-coil模體上。Spt4:Spt5所處的這一位置位于DNA出口處,在這里,完成了轉(zhuǎn)錄的DNA重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu),并通過(guò)DNA出口排出。在本次工作中,我們通過(guò)核磁共振化學(xué)位移擾動(dòng)和熒光偏振實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了Spt4:Spt5結(jié)合DNA的能力；并通過(guò)解析和分析MjSpt4:Spt5的晶體結(jié)構(gòu),猜測(cè)了一個(gè)位于Spt4:Spt5上可能的DNA結(jié)合區(qū)域；并從兩套衍射數(shù)據(jù)解析的模型中捕捉到了Spt4:Spt5兩種不同的構(gòu)象,進(jìn)而分析了兩種構(gòu)象對(duì)Spt4:Spt5結(jié)合DNA能力的影響；通過(guò)結(jié)合定點(diǎn)突變和熒光偏振實(shí)驗(yàn),我們最終構(gòu)建了一個(gè)Spt4:Spt5結(jié)合DNA的模型,進(jìn)而構(gòu)建了一個(gè)包含了RNA聚合酶、Spt4:Spt5復(fù)合物和DNA三個(gè)元素的RNA聚合酶DNA出口模型,并通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模擬驗(yàn)證了此模型的正確性。ErbB2隸屬于酪氨酸蛋白激酶家族中的表皮生長(zhǎng)因子受體亞家族,這類跨膜蛋白通過(guò)胞外結(jié)構(gòu)域的二聚化激活其胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶活性,進(jìn)而互相催化對(duì)方的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域C末端尾巴并進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路。ErbB2負(fù)責(zé)調(diào)控包括細(xì)胞復(fù)制和凋亡的多條重要信號(hào)通路,其活性異常會(huì)導(dǎo)致乳腺癌等近十種癌癥,并有著更高轉(zhuǎn)移性。因而,近年來(lái)ErbB2成為了抗腫瘤治療的重要靶標(biāo)分子。中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)的細(xì)胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)一直致力于抗ErbB2抗體的研發(fā),并開(kāi)發(fā)了一株具有抗腫瘤活性的人鼠嵌合抗體chA21。近期,該實(shí)驗(yàn)室完成了對(duì)chA21的人源化,并通過(guò)親和力成熟技術(shù)制備了具有高親和力的人源化抗ErbB2抗體E9。我們與細(xì)胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室合作,通過(guò)X射線衍射方法解析了E9 scFv片段與ErbB2完整胞外結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu),確認(rèn)了E9在ErbB2上的結(jié)合位置；并發(fā)現(xiàn)在抗原—抗體結(jié)合界面上,原先chA21所結(jié)合的抗原表面三條loop變成了兩條,解釋了E9親和力提升的原因；結(jié)合ELISA和腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)抑制試驗(yàn)闡明了抗體CDR區(qū)相對(duì)距離對(duì)E9抗腫瘤能力的影響,進(jìn)一步補(bǔ)充了E9下調(diào)ErbB2模型的細(xì)節(jié)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1250901