本文關(guān)鍵詞：低溫脅迫下小胸鱉甲的轉(zhuǎn)錄組分析及差異表達(dá)基因幾丁質(zhì)酶的初步研究

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【摘要】：小胸鱉甲(Microdera punctipennis)隸屬于鞘翅目擬步甲科,是分布于中國西北地區(qū)古爾班通古特沙漠的“指示生物”之一�；哪貐^(qū)生境嚴(yán)酷,尤其是晝夜溫差和季節(jié)溫差極大。擬步甲科昆蟲是分布于該區(qū)域的優(yōu)勢種群,有極強(qiáng)的抗干旱、抗高溫及抗凍等多種抗逆性,因此,具有多種抗逆基因和分子機(jī)制可待發(fā)掘和利用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)昆蟲抗凍蛋白基因(Antifreeze protein,afp)及熱激蛋白基因(Heat shock protein,hsp)等眾多基因在其適應(yīng)荒漠環(huán)境的分子機(jī)制中發(fā)揮重要作用。隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展,有助于發(fā)現(xiàn)更多新的參與昆蟲環(huán)境適應(yīng)性的基因和信號途徑。本文采用Illumina高通量測序技術(shù)分別對4°C處理3 h(CD)和未經(jīng)低溫處理(CK)的小胸鱉甲成蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,獲得了該昆蟲大量的差異表達(dá)基因信息,分析了其響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄水平變化,從宏觀角度探討了基因表達(dá)變化在昆蟲低溫脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮的作用;此外,對低溫誘導(dǎo)后表達(dá)水平顯著上調(diào)的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行表達(dá)和初步的功能分析。主要取得如下結(jié)果:(1)正常對照組(CK)的轉(zhuǎn)錄組基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析:未經(jīng)處理小胸鱉甲成蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過組裝拼接最終獲得56,348個(gè)unigene,平均長度為666 bp。與已知蛋白數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)41,109個(gè)unigene(72.96%)與已知蛋白序列高度相似(E-value10-5)。此外,對unigene進(jìn)行GO、COG/KOG和KEGG的功能注釋、分類或代謝通路分析,結(jié)果顯示大部分基因與環(huán)境脅迫相關(guān),包括編碼熱激蛋白hsp、抗凍蛋白afp基因,此外還有一些酶類如幾丁質(zhì)酶、海藻糖酶和海藻糖-6-磷酸合成酶等。(2)低溫處理組(CD)和正常對照組(CK)的轉(zhuǎn)錄組基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析:對小胸鱉甲成蟲低溫脅迫與正常對照兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)合并后進(jìn)行拼接組裝,發(fā)現(xiàn)所獲得的所有144,777個(gè)unigene的平均長度為463 bp。對所有unigene進(jìn)行BLASTX搜索(E10-5)發(fā)現(xiàn)共有51,447個(gè)unigene(35.54%)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的已知序列同源,還有大量unigene(64.46%)未能注釋,這是由于大多數(shù)較短unigene(300 bp)不能通過BLASTX比對獲得同源序列信息。大量已知及未知功能基因的獲得,擴(kuò)充了昆蟲低溫特異性表達(dá)基因的數(shù)目,充分顯示出轉(zhuǎn)錄組測序手段在基因序列數(shù)據(jù)挖掘上的巨大潛力,為深入研究荒漠昆蟲的低溫響應(yīng)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。(3)轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因分析:對兩組樣品轉(zhuǎn)錄組之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果表明共有92,010個(gè)unigene的表達(dá)水平發(fā)生了變化,其中有48,416個(gè)unigene上調(diào),43,594個(gè)下調(diào)。go功能富集分析發(fā)現(xiàn)具有水解酶活性的(go:0016787)unigene數(shù)量最多,其中1,231個(gè)水解酶活性相關(guān)的unigene上調(diào)表達(dá)。利用goslim功能富集分析發(fā)現(xiàn),低溫脅迫下部分unigene的生物學(xué)功能集中在對非生物脅迫的響應(yīng)方面,包括對溫度應(yīng)激響應(yīng)(go-id:9266),脅迫響應(yīng)(go-id:6950),熱激響應(yīng)(go-id:9408),氧化脅迫應(yīng)激響應(yīng)(go-id:6979)以及體溫調(diào)節(jié)(go-id:43052)等生物學(xué)過程。與溫度相關(guān)的unigene包括絲裂原激活蛋白激酶激酶mkk7(mitogen-activatedproteinkinasekinase7)、組氨酸脫羧酶hdc(histidinedecarboxylase)、分子伴侶dnaj(molecularchaperonednaj)、熱激蛋白hspa5/bip(heatshockprotein5)、神經(jīng)纖維瘤蛋白1nf1(neurofibromin1)等。所獲得的所有unigene中,在兩組樣品中共表達(dá)的有38,667個(gè),僅在低溫處理組中特異性表達(dá)的unigene有28,678個(gè),僅在正常對照組中特異性表達(dá)的unigene有24,671個(gè),這在一定程度上表明不同的基因在低溫條件下其表達(dá)存在著時(shí)空特異性。采用real-timepcr技術(shù)驗(yàn)證了13個(gè)表達(dá)差異基因在4oc低溫處理3h后的表達(dá)水平變化,其結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)結(jié)果基本一致。對低溫響應(yīng)相關(guān)基因的挖掘和鑒定將為后續(xù)的功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。(4)最顯著的差異表達(dá)基因—幾丁質(zhì)酶基因mpcht12抗血清的制備:在水解酶活性相關(guān)unigene分析中發(fā)現(xiàn),幾丁質(zhì)酶基因是小胸鱉甲成蟲低溫轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)變化最為顯著的類群之一,共有106個(gè)序列被注釋為幾丁質(zhì)酶(e3.2.1.14),其中一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因(unigeneidno.786seq1)受低溫誘導(dǎo)表達(dá)水平顯著升高,系統(tǒng)進(jìn)化樹分析該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于iv型昆蟲幾丁質(zhì)酶,命名為mpcht12。構(gòu)建真核表達(dá)載體pcdna3-mpcht12,rt-pcr檢測其在小鼠肝臟特異性表達(dá)。構(gòu)建原核表達(dá)載體pet30a-mpcht12并表達(dá)純化獲得重組蛋白his-mpcht12。對昆明白小鼠采用核酸初免—蛋白加強(qiáng)的免疫方法,經(jīng)pcdna3-mpcht12質(zhì)粒免疫后,再用his-mpcht12融合蛋白加強(qiáng)免疫,收集血清,通過westernblot和elisa檢測,結(jié)果表明抗血清效價(jià)高達(dá)1:204800。(5)mpcht12基因的表達(dá)模式及功能初步分析:mrna水平上mpcht12基因在小胸鱉甲成蟲不同組織的表達(dá)水平為:脂肪體后腸前腸體壁中腸,其中脂肪體的表達(dá)水平約為中腸的10倍,免疫組化結(jié)果顯示MpCHT12在脂肪體和中腸都有表達(dá)。低溫處理的表達(dá)譜分析結(jié)果顯示,該基因在4oC處理下7 h后的表達(dá)上調(diào)最為顯著。應(yīng)用STRING在線軟件對MpCHT12進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析,共預(yù)測到22個(gè)與MpCHT12有互作關(guān)系的蛋白,其中預(yù)測到7個(gè)與MpCHT12有直接互作關(guān)系的蛋白,包括類N乙酰D-葡萄糖激酶,β類氨基己糖苷酶B,類β氨基己糖苷酶亞基α,類氨基己糖苷酶A,fused lobes(FDL),β-N乙酰葡糖胺糖苷酶NAG2和氨基己糖苷酶NAG1。Mpcht12基因的低溫表達(dá)模式說明其可能在小胸鱉甲低溫適應(yīng)中發(fā)揮作用,互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析對于小胸鱉甲成蟲低溫脅迫下分子機(jī)制的深入研究有提示作用。(6)6個(gè)差異表達(dá)幾丁質(zhì)酶基因的組織及低溫表達(dá)模式分析:對小胸鱉甲低溫轉(zhuǎn)錄組中獲得的6個(gè)差異表達(dá)幾丁質(zhì)酶基因(394seq2,1184seq1,19417seq2,200seq3,5176seq3和7762seq6)進(jìn)行鑒定和表達(dá)模式分析。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示,6個(gè)幾丁質(zhì)酶基因分別屬于3種不同的類型。組織特異性分析結(jié)果顯示幾乎所有基因都在中腸高表達(dá),個(gè)別在脂肪體和后腸中也有表達(dá)。 4oC處理不同時(shí)間幾丁質(zhì)酶基因的整體表達(dá)水平高于4oC處理不同時(shí)間后幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)水平。小胸鱉甲幾丁質(zhì)酶基因以多基因家族形式存在。幾丁質(zhì)酶的組織特異性表達(dá)和低溫誘導(dǎo)表達(dá)說明其可能有多重功能且在昆蟲的低溫適應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q963

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1 趙曉琴,李冠;幾丁質(zhì)酶研究進(jìn)展[J];新疆大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2003年04期

2 陳少波,吳根福;幾丁質(zhì)酶研究進(jìn)展[J];科技通報(bào);2004年03期

3 關(guān)海寧;徐桂花;刁小琴;;微生物產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的研究概況及其應(yīng)用[J];中國食物與營養(yǎng);2006年08期

4 黃乾生;謝曉蘭;陳清西;;幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)特征與功能[J];廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2008年S2期

5 李春霞;佟永薇;侯世潔;;微生物幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展[J];食品研究與開發(fā);2008年08期

6 陳崇順,徐鳳彩,李明啟;21科41種(變種)植物葉片幾丁質(zhì)酶系的研究[J];植物資源與環(huán)境;1993年04期

7 陳三鳳,李季倫;幾丁質(zhì)酶研究歷史和發(fā)展前景[J];微生物學(xué)通報(bào);1993年03期

8 楊承勇,周世寧;幾丁質(zhì)酶的研究及應(yīng)用前景[J];仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào);1999年01期

9 楊承勇,周世寧,周毅頻,林永成;海洋細(xì)菌11211的生長條件及其幾丁質(zhì)酶研究[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2000年06期

10 歐陽石文,趙開軍,馮蘭香,謝丙炎;植物幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展[J];生物工程進(jìn)展;2001年04期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳崇順;朱雪峰;郁志芳;;蔬菜植物幾丁質(zhì)酶最新研究評述[A];中國科協(xié)第3屆青年學(xué)術(shù)年會(huì)園藝學(xué)衛(wèi)星會(huì)議暨中國園藝學(xué)會(huì)第2屆青年學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];1998年

2 周洪妹;郭慶港;李社增;鹿秀云;馬平;;幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的篩選及其基因克隆[A];中國植物病理學(xué)會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2009年

3 劉明艷;田玉敬;張洪斌;;昆蟲幾丁質(zhì)酶的分離純化及其抑制劑篩選的研究[A];2010年中國藥學(xué)大會(huì)暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

4 蔡銀杰;;幾丁質(zhì)用于植物病害生物防治——幾丁質(zhì)對土壤微生物的作用[A];全國生物防治學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];1995年

5 林毅;方光偉;彭琨;;蘇云金桿菌4H2菌株幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生條件的研究[A];第一屆全國化學(xué)工程與生物化工年會(huì)論文摘要集(下)[C];2004年

6 王海東;宋小慧;何騰騰;胡忠;;海洋微生物新幾丁質(zhì)酶編碼基因的探索[A];中國遺傳學(xué)會(huì)第八次代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

7 郝之奎;蔡宇杰;廖祥儒;張峰;童超;;一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細(xì)菌的篩選與鑒定[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2010年

8 張文娟;李聰;王步云;;幾丁質(zhì)酶與苜�？共⌒匝芯縖A];中國草學(xué)會(huì)牧草育種委員會(huì)第七屆代表大會(huì)論文集[C];2009年

9 申屠旭萍;俞曉平;;幾丁質(zhì)酶抑制劑的研究進(jìn)展[A];第三屆全國綠色環(huán)保農(nóng)藥新技術(shù)、新產(chǎn)品交流會(huì)暨第二屆全國生物農(nóng)藥研討會(huì)論文集[C];2004年

10 鐘萬芳;郭慧芳;方繼朝;;Serratia sp.幾丁質(zhì)酶基因的比較研究[A];植�？萍紕�(chuàng)新與病蟲防控專業(yè)化——中國植物保護(hù)學(xué)會(huì)2011年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2011年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 記者 林岳夫;海洋微生物幾丁質(zhì)酶研究取得進(jìn)展[N];中國海洋報(bào);2001年

2 本報(bào)記者 林岳夫 李文星;而今邁步從頭越[N];中國海洋報(bào);2002年

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1 郝之奎;Chitinolyticbacter meiyuanensis的篩選鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶研究[D];江南大學(xué);2011年

2 陸雪瑩;低溫脅迫下小胸鱉甲的轉(zhuǎn)錄組分析及差異表達(dá)基因幾丁質(zhì)酶的初步研究[D];新疆大學(xué);2015年

3 張婕;嗜熱真菌熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶基因的克隆、表達(dá)與分子改造[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 沙莉;蘇云金芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶活性研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2011年

5 劉東;蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶特性分析及其基因啟動(dòng)子序列的確定[D];南開大學(xué);2010年

6 王艷君;角毛殼菌Chi58基因克隆與密碼子優(yōu)化及在畢赤酵母中的高效表達(dá)[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2009年

7 郭潤芳;疏綿狀嗜熱絲孢菌熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶純化及其編碼基因的克隆與表達(dá)[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

8 范艷華;球孢白僵菌降解寄主體壁的幾丁質(zhì)酶和蛋白酶的分子改良[D];西南大學(xué);2006年

9 陶勇;一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細(xì)菌的鑒定、酶的性質(zhì)及其基因的克隆與表達(dá)[D];四川大學(xué);2006年

10 緱敬軒;幾丁質(zhì)及高附加值產(chǎn)物酶法生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究[D];陜西科技大學(xué);2012年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 金香;幾丁質(zhì)降解菌的篩選、鑒定及酶學(xué)特性的研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2007年

2 姚祥春;氣單胞菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的工藝條件優(yōu)化和應(yīng)用初探[D];浙江工業(yè)大學(xué);2008年

3 劉丹;產(chǎn)幾丁質(zhì)酶渤海絲狀真菌（Alternaria tenuissima）的篩選、鑒定及產(chǎn)酶研究[D];天津師范大學(xué);2012年

4 王永娟;嗜線蟲致病桿菌幾丁質(zhì)酶基因原核表達(dá)及生物活性研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 于愷;嗜熱子囊菌光孢變種幾丁質(zhì)酶基因的克隆和表達(dá)[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

6 熊晶;產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選與鑒定及幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)研究[D];中南大學(xué);2009年

7 陳紅;廣譜抗病蟲幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的篩選與幾丁質(zhì)酶分子生物學(xué)研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

8 鄭秀麗;幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及幾丁質(zhì)裂解酶基因的克隆與表達(dá)[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

9 張榮奎;土壤中產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選、鑒定、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)的研究[D];華僑大學(xué);2006年

10 古麗皮艷;具有抑菌作用的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2006年

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本文編號：1222829