本文關(guān)鍵詞：坦布蘇病毒ZC株感染性克隆的構(gòu)建和部分3’非編碼區(qū)功能的初步研究

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【摘要】：坦布蘇病毒感染是2010年春季在我國(guó)江浙一帶出現(xiàn)的一種鴨的新發(fā)傳染性疾病。該病發(fā)生迅速,傳播速度快,發(fā)病范圍廣。目前已確定該病毒可以感染多個(gè)品種鴨、鵝等�；记葜饕Y狀為:體溫升高、四肢無力、癱瘓;產(chǎn)蛋大幅下降;出現(xiàn)頭頸震顫等神經(jīng)癥狀;排草綠色稀便,氣味惡臭。該病感染率可高達(dá)90%以上,死亡率在5%~10%。產(chǎn)蛋期鴨產(chǎn)蛋率由90%左右很快降至20%甚至更低。該病嚴(yán)重影響蛋鴨、種鴨的生產(chǎn)性能,危害著我國(guó)水禽業(yè)的健康發(fā)展。坦布蘇病毒為正鏈RNA病毒,病毒粒子直徑約50nm,有囊膜,基因組大小為10,990個(gè)核苷酸,含有一個(gè)長(zhǎng)的開放閱讀框,其編碼的多聚蛋白經(jīng)水解、剪切、加工后形成3種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白、膜蛋白前體和囊膜蛋白)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(非結(jié)構(gòu)蛋白1、2A、2B、3、4A、4B和5)。ORF兩端分別為3’和5’非編碼區(qū),長(zhǎng)度分別為94個(gè)核苷酸和618個(gè)核苷酸。相關(guān)研究表明黃病毒屬成員非編碼區(qū)形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和毒力有關(guān)。本研究中我們對(duì)分離鑒定的兩株水禽源坦布蘇病毒進(jìn)行全基因組序列測(cè)定與分析;并選取一株鴨源分離株構(gòu)建感染性克隆和病毒拯救,為研究病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能、病毒編碼蛋白功能和分子致病機(jī)理提供技術(shù)支持;利用建立的坦布蘇病毒反向遺傳操作平臺(tái)和融合PCR技術(shù),對(duì)3’端CS序列和次末端堿基進(jìn)行了點(diǎn)突變,以探究基因組中兩種結(jié)構(gòu)的生物學(xué)功能。1.坦布蘇病毒Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的建立根據(jù)Genbank公布的TMUV的NS1基因中保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物和中間一條Taqman探針,建立了一種適用于TMUV檢測(cè)的熒光定量RT-PCR方法。結(jié)果顯示,該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-2.9227x+42.083,R2=0.9972;特異性強(qiáng),H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、鴨瘟病毒、鴨甲型肝炎病毒、鴨呼腸孤病毒和鴨圓環(huán)病毒等可感染鴨病原核酸模板擴(kuò)增結(jié)果均為陰性;靈敏性高,最低檢測(cè)敏感度為29 copies/μL。該方法適用于TMUV核酸的快速檢測(cè),可應(yīng)用于空氣中、棉拭子樣品直接檢測(cè),缺點(diǎn)是需要昂貴的儀器設(shè)備。2.兩株坦布蘇病毒的分離鑒定和全基因組測(cè)序分析對(duì)送檢的疑似坦布蘇病毒感染的發(fā)病鴨、鵝進(jìn)行了病原的分離和鑒定。參考Genbank中收錄的TMUV全基因組序列,設(shè)計(jì)6對(duì)引物引物,結(jié)合5’race RT-PCR技術(shù)進(jìn)行了兩株tmuv分離株的全基因組序列測(cè)定和分析。結(jié)果成功分離到1株鴨源(zc株)和1株鵝源(lq株)的tmuv。接種9日齡鴨胚測(cè)得eld50分別為10-4.2/ml和10-3.6/ml。動(dòng)物回歸試驗(yàn)顯示兩株分離株均可引起雛鴨典型的神經(jīng)癥狀。全基因組核苷酸序列同源性分析表明,lq株和zc株與sx1株同源關(guān)系最近,分別為99.1%和99%。e和ns1蛋白氨基酸同源性分析表明,兩株分離株與其他tmuv分離株之間沒有明顯的遺傳變異。親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的fjmh220株、ah2011株和gx2013g株三株tmuv均為番鴨源,tmuv毒株之間是否存在宿主差異性還有待進(jìn)一步研究。3.坦布蘇病毒反向遺傳操作的建立根據(jù)tmuvzc株全基因組測(cè)序結(jié)果結(jié)合genbank中收錄的tmuv全基因組序列以及酶切位點(diǎn)分析,設(shè)計(jì)了7對(duì)引物進(jìn)行rt-pcr擴(kuò)增。對(duì)低拷貝載體pwsk29進(jìn)行多克隆位點(diǎn)的改造并命名為pwsk29c。將各段依次克隆至pwsk29c中,在5’末端加入t7啟動(dòng)子序列和taa轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子,并引入apai酶切位點(diǎn);在3’末端加入t7rna酶識(shí)別終止序列,在序列上、下游分別引入avrii和noti酶切位點(diǎn),構(gòu)建的感染性克隆質(zhì)粒中(c10495g)位點(diǎn)突變作為分子標(biāo)簽,構(gòu)建的感染性克隆質(zhì)粒(命名為pwsk29c-dtmuv)。該質(zhì)粒經(jīng)noti酶切線性化后,通過t7體外轉(zhuǎn)錄為具有感染性的rna,純化后轉(zhuǎn)染bhk21細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)72h后凍融三次,離心收集上清,對(duì)收獲的拯救毒株進(jìn)行鑒定。測(cè)序顯示結(jié)果成功構(gòu)建了tmuvzc株的感染性克隆質(zhì)粒,并引入t7轉(zhuǎn)錄元件和酶切位點(diǎn);rt-pcr檢測(cè)為陽性;間接免疫熒光反應(yīng)顯示其與tmuvmab12b1具有良好的反應(yīng)性;全基因組序列分析顯示,10495位分子標(biāo)簽具有穩(wěn)定的遺傳性;致病性試驗(yàn)顯示,拯救株zc1株的eld50為10-3.8/ml,毒力略高于親本株,拯救株zc1株與親本株zc株感染雛鴨均出現(xiàn)明顯的癥狀,病毒的一步生長(zhǎng)曲線和雛鴨感染后存活曲線也相似。構(gòu)建的tmuv反向遺傳操作為研究tmuv的基因組結(jié)構(gòu)和功能、病毒編碼蛋白功能以及分子致病機(jī)理等方面的研究提供了技術(shù)支持。4.3’非編碼區(qū)功能的初步研究以構(gòu)建的zc株感染性克隆質(zhì)粒pwsk29c-dtmuv為骨架,進(jìn)行3’端保守序列和次末端堿基的突變,并進(jìn)行毒株的拯救和鑒定,進(jìn)而分析3’非編碼區(qū)部分結(jié)構(gòu)的生物學(xué)功能。病毒基因組cdna序列經(jīng)酶切位點(diǎn)分析在9761位agei限制性酶切位點(diǎn)為單一酶切位點(diǎn)。將cs序列前后片段分別擴(kuò)增后,采用融合pcr技術(shù)進(jìn)行cs缺失片段的擴(kuò)增,經(jīng)雙酶切后克隆至pwsk29c-dtmuv中,構(gòu)建cs序列缺失感染性克隆重組真核表達(dá)質(zhì)粒。首輪進(jìn)行pcr擴(kuò)增至tmuv基因組10985位,以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行3’次末端點(diǎn)突變片段的擴(kuò)增,經(jīng)雙酶切克隆至pWSK29C-DTMUV中,構(gòu)建3’次末端堿基點(diǎn)突變感染性克隆重組真核表達(dá)質(zhì)粒。突變質(zhì)粒經(jīng)Not I酶切線性化后,經(jīng)T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄獲得感染性RNA,轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)72h,凍融三次離心后收集上清。將收獲的病毒液進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,除CS1序列缺失毒株沒有成功拯救外,其他毒株均成功拯救。在該位點(diǎn)突變毒株拯救過程中,C→G突變并未顯著影響病毒的增殖,而缺失或突變?yōu)锳、T堿基卻使得病毒增殖緩慢。由于未對(duì)3’次末端堿基突變株進(jìn)行序列測(cè)定,因此,是否出現(xiàn)了回位突變導(dǎo)致毒株的增殖也有待進(jìn)一步驗(yàn)證。而CS缺失突變株拯救拯救結(jié)果表明,CS1序列在病毒基因組復(fù)制過程中具有極為重要的作用,RCS2和RCS3序列的缺失對(duì)病毒復(fù)制增殖過程具有一定的抑制作用,而CS2和CS3的缺失并不影響病毒的復(fù)制增殖,但其缺失突變病毒的毒力是否發(fā)生變化也有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1147960