本文關(guān)鍵詞：Ccnyl1在精子發(fā)生過程中的功能研究

  更多相關(guān)文章： Ccnyl1 Cdk16 雄性不育 精子活力 精子發(fā)生 激酶活性 蛋白穩(wěn)定性

【摘要】：細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)是一類在細(xì)胞周期活動(dòng)中起關(guān)鍵作用的蛋白。目前,Cyclins家族已經(jīng)鑒定了很多成員,它們的共同特征是都含有保守的周期蛋白框序列(Cyclin Box)。通常,Cyclins與周期蛋白依賴性激酶(Cdks)相互作用,通過影響Cdks的蛋白激酶活性而發(fā)揮功能。雖然Cyclins/Cdks蛋白的功能最初在細(xì)胞周期活動(dòng)中鑒定,但是目前研究發(fā)現(xiàn),除調(diào)控細(xì)胞周期外,CyclinS/Cdks蛋白還可以參與調(diào)控很多其他細(xì)胞活動(dòng)。Ccnyll是一個(gè)新鑒定的Cyclins蛋白成員,它與同家族中的Ccny蛋白有79%的序列相似性,但其功能尚未有研究。本研究發(fā)現(xiàn)Ccnyll基因特異高表達(dá)于小鼠睪丸組織中,而在其它組織中表達(dá)較低。由于Ccnyll與Ccny為同源蛋白,我們也檢測(cè)了小鼠睪丸組織中Ccny的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在睪丸中Ccny的表達(dá)量遠(yuǎn)低于ccnyll。同時(shí)我們還檢測(cè)了不同發(fā)育時(shí)期Ccnyll和Ccny在小鼠睪丸組織中的表達(dá)變化,結(jié)果顯示Ccnyl從三周齡開始迅速表達(dá),并在性成熟后達(dá)到高峰,然后趨于穩(wěn)定表達(dá)；而Ccny的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定,變化較小。組織切片免疫染色及流式分選實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Ccnyll主要表達(dá)于處于減數(shù)分裂的生精細(xì)胞、圓形和延長(zhǎng)形精子中。以上結(jié)果提示Ccnyll可能在精子生成過程中發(fā)揮重要作用。為闡明Ccnyll的功能,我們利用Ccnyll基因敲除小鼠(Ccnyll-/-)來(lái)進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)Ccnyll-/-小鼠生長(zhǎng)發(fā)育正常；成年后,雌性小鼠具有正常生育能力,但是雄性小鼠不育。同時(shí),我們也檢測(cè)了Ccny-/-小鼠的生育能力,發(fā)現(xiàn)Ccny-/-雄性和雌性小鼠均能正常生育。以上結(jié)果表明是Ccnyll,而不是Ccny,在小鼠雄性生殖中發(fā)揮重要功能。為進(jìn)一步研究探索Ccnyll-/-小鼠雄性不育的原因,我們檢測(cè)了Ccnyll-/-小鼠雄性生殖器官的形態(tài)和重量,血清中睪酮和促卵泡激素的含量,生精小管的形態(tài)及結(jié)構(gòu),生精小管中各類群生殖細(xì)胞的數(shù)目和所占比例,各類群生殖細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)水平,以及小鼠附睪頭部和尾部的精子數(shù)目,但均沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。以上結(jié)果均表明Ccnyll不影響雄性生殖器官的發(fā)育、激素分泌以及精子生成和精子數(shù)目。我們利用Computer-assisted semen analysis(CASA)技術(shù)分析小鼠精子活力,結(jié)果顯示Ccnyll-/-小鼠精子活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型小鼠。在相差顯微鏡下觀察精子結(jié)構(gòu),我們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠的精子相比,ccnyll-/-小鼠的精子形態(tài)異常,表現(xiàn)為：精子頭在頸部彎曲折向中段,中段和主段連接的區(qū)域變細(xì),并發(fā)生彎折。在微分干涉差顯微鏡下觀察精子結(jié)構(gòu),我們發(fā)現(xiàn)Ccnyll-/-小鼠精子的中段與主段連接區(qū)域的殘滴結(jié)構(gòu)缺失。后續(xù)的體外精子獲能和體外受精實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Ccnyll-/-小鼠精子獲能正常,但是體外受精率嚴(yán)重下降。上述結(jié)果提示Ccnyll通過影響精子形態(tài)和精子活力進(jìn)而導(dǎo)致小鼠不育。為進(jìn)一步分析Ccnyll-/-小鼠精子結(jié)構(gòu)異常及活力下降的原因,首先,我們用透射電鏡觀察精子結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示精子頭部結(jié)構(gòu)正常,但部分精子頭部折向中段,并被殘留的殘?bào)w包��；精子中段與主段間的Annulus結(jié)構(gòu)正常,但與線粒體脫離接觸,間隙變大,導(dǎo)致此區(qū)域變細(xì),并發(fā)生彎折。由于精子中段線粒體結(jié)構(gòu)以及排列數(shù)均正常,線粒體標(biāo)志蛋白Cytochrome C和Cytochrome c oxidase subunit 4的蛋白表達(dá)量沒有明顯差異,表明精子中段和主段間的間隙變大并不是由于線粒體缺失導(dǎo)致。其次,免疫染色發(fā)現(xiàn),Ccnyll-/-小鼠的部分精子在中段與主段之間有微絲、微管散出,透射電鏡結(jié)果也證實(shí)了這一現(xiàn)象,提示微絲、微管合成或組裝可能存在異常,因此我們檢測(cè)了精子中微絲、微管蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,Ccnyll-/-小鼠精子中α-tubulin的蛋白量與野生型小鼠沒有差異,但β-actin的蛋白量顯著增加。因此,我們檢測(cè)了細(xì)胞骨架合成及組裝相關(guān)蛋白的表達(dá)及活力,發(fā)現(xiàn)Ccnyll-/-小鼠精子細(xì)胞骨架的組裝及解聚都沒有異常。以上結(jié)果提示,Ccnyll-/-小鼠精子中β-actin蛋白量增加是由于頭部與頸部的殘?bào)w殘留導(dǎo)致,而Ccnyll-/--小鼠精子微絲、微管散出可能是由于精子尾部折斷導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)完整性被破壞而產(chǎn)生。Ccnyll是通過怎樣的機(jī)制來(lái)影響精子的形態(tài)及功能呢?首先,我們利用睪丸組織的基因表達(dá)芯片來(lái)尋找靶基因(accession no.GSE67391),但Ccnyll-/-小鼠與對(duì)照小鼠之間的表達(dá)差異很小,提示Ccnyll可能并非通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮作用。其次,鑒于Ccnyll和Ccny是高度同源蛋白,文獻(xiàn)報(bào)道Ccny可以與Cdkl4相互作用而調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。因此我們檢測(cè)了經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白,但均沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化,提示Ccnyll并不參與調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。通過比對(duì)已知的基因缺失或突變小鼠表型,我們發(fā)現(xiàn)Ccnyll-/-小鼠表型與Cdkl6-/-小鼠表型類似。因此我們檢測(cè)了Ccnyll-/--小鼠睪丸組織中Cdk16的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Cdk16 tuRNA表達(dá)水平與對(duì)照組小鼠沒有差異,但Cdk16蛋白水平顯著低于對(duì)照小鼠。提示Ccnyll與Cdk16蛋白之間存在相互作用。免疫熒光共定位結(jié)果顯示Ccnyll與Cdkl6在睪丸組織中存在共定位,特別是在延長(zhǎng)形精子中。體內(nèi)及體外免疫共沉淀結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)Ccnyll與Cdk16之間存在相互作用。Ccnyll與Cdkl6相互作用,并且Ccnyll缺失導(dǎo)致Cdkl6蛋白水平下降,由此我們推測(cè),Ccnyll可能影響Cdk16蛋白穩(wěn)定性或Cdkl6的翻譯。通過蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以及抑制蛋白降解實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)Ccnyll與Cdkl6結(jié)合后能顯著增強(qiáng)彼此的蛋白穩(wěn)定性。此外,我們發(fā)現(xiàn)在Ccnyll-/-小鼠的睪丸組織中,Cdkl6蛋白的條帶位置略低于對(duì)照組,堿性磷酸酶處理后,兩組之間的差異消失,提示兩組小鼠的Cdkl6蛋白磷酸化修飾存在差異。通過質(zhì)譜技術(shù),我們鑒定了Cdk16的磷酸化修飾位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)Cdk16蛋白的氮端高度磷酸化。我們共鑒定出了22個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中19個(gè)可信位點(diǎn)。在這19個(gè)可信位點(diǎn)中,有9個(gè)位點(diǎn)是從未報(bào)道過的新位點(diǎn),分別是S36、S64、S65、S89、S146、T175、T380、S391和S478。當(dāng)Ccnyl1與Cdkl6共表達(dá)時(shí),Cdkl6的S36、S146、T175和S480位點(diǎn)磷酸化水平顯著增強(qiáng),而S78磷酸化水平顯著降低,說明Ccnyl1結(jié)合會(huì)影響Cdkl6的磷酸化修飾。為驗(yàn)證Cdk1 6磷酸化修飾對(duì)其與Ccnyl1相互作用的影響,我們構(gòu)建了點(diǎn)突變克隆,并發(fā)現(xiàn)Cdkl6氮端的磷酸化修飾對(duì)Cdkl6與Ccnyl1的結(jié)合具有重要作用。另外,酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Cdk16自身激酶活性很低,但與Ccnyl1結(jié)合后酶活顯著增強(qiáng)。在新鑒定的Cdk16磷酸化位點(diǎn)中,S146磷酸化對(duì)Cdkl6與Ccnyl1的結(jié)合至關(guān)重要。S146A及S146D突變都引起Cdkl6自身激酶活性降低,同時(shí)阻斷Cdk16與Ccnyl1的結(jié)合。因此Cdk16的磷酸化修飾不僅影響與Ccnyl1蛋白結(jié)合,影響彼此的蛋白穩(wěn)定性,而且也會(huì)影響自身的激酶活性�？傊�,我們的研究首次揭示了Ccnyl1的功能,并闡明Ccnyl1通過與Cdkl6相互作用,在精子生成及雄性生殖中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。鑒于Ccnyl1的表達(dá)特異性,且并不影響小鼠生長(zhǎng)發(fā)育及激素水平,Ccnyl1可以作為研發(fā)干預(yù)雄性生殖藥物的理想靶點(diǎn)。此外,越來(lái)越多的小鼠模型中的研究不斷豐富了我們對(duì)雄性不育基因因素的認(rèn)識(shí),這將對(duì)臨床診斷、治療及轉(zhuǎn)化研究提供重要理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：Ccnyl1 Cdk16 雄性不育 精子活力 精子發(fā)生 激酶活性 蛋白穩(wěn)定性
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q492
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-14
• 第1章 緒論14-42
• 1.1 周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶14-22
• 1.1.1 周期蛋白和周期蛋白依賴蛋白激酶概述14
• 1.1.2 周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物14-15
• 1.1.3 Cyclins/CdKs蛋白復(fù)合物的功能15-22
• 1.2 精子發(fā)生過程22-36
• 1.2.1 小鼠雄性生殖系統(tǒng)22-23
• 1.2.2 小鼠睪丸結(jié)構(gòu)及生精小管的組成23-25
• 1.2.3 精子的生成過程25-29
• 1.2.4 精子發(fā)生的調(diào)控29-33
• 1.2.5 不同類型的生殖細(xì)胞的特點(diǎn)及分選33-36
• 1.3 精子的結(jié)構(gòu)36-40
• 1.4 受精過程及雄性不育40-42
• 第2章 Ccnyl1在精子發(fā)生過程中的作用研究42-96
• 2.1 實(shí)驗(yàn)方法與材料42-63
• 2.1.1 細(xì)胞系及培養(yǎng)42
• 2.1.2 小鼠模型42-43
• 2.1.3 Western Blot實(shí)驗(yàn)43-46
• 2.1.4 RNA的抽提及Realtime-PCR實(shí)驗(yàn)46-48
• 2.1.5 細(xì)胞和組織的Co-IP實(shí)驗(yàn)48-49
• 2.1.6 激酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)49-50
• 2.1.7 分離睪丸中的生殖細(xì)胞、流式細(xì)胞儀分選或檢測(cè)和Ca~(2+)、pH檢測(cè)50-51
• 2.1.8 組織石蠟切片、免疫組化、HE染色及免疫熒光51-54
• 2.1.9 芯片和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)54
• 2.1.10 Testis和Sperm透射電鏡實(shí)驗(yàn)54-55
• 2.1.11 精子活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(CASA)、精子計(jì)數(shù)、和精子獲能實(shí)驗(yàn)55-57
• 2.1.12 小鼠基因型鑒定57-58
• 2.1.13 精子涂片58
• 2.1.14 Testis、Germ cells、Sperm的G/F-Actin分離實(shí)驗(yàn)58-59
• 2.1.15 RhoA/Cdc42/Rac1活性檢測(cè)59
• 2.1.16 血清中睪酮和促卵泡素含量檢測(cè)59-60
• 2.1.17 體外受精實(shí)驗(yàn)60
• 2.1.18 其他實(shí)驗(yàn)試劑、儀器和抗體60-63
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果63-92
• 2.2.1 Ccnyl1與Ccny蛋白具有高度同源性63
• 2.2.2 Ccnyl1和Ccny基因表達(dá)圖譜63-65
• 2.2.3 Ccnyl1主要表達(dá)于減數(shù)分裂的生精細(xì)胞以及圓形精子和延長(zhǎng)形精子中65-67
• 2.2.4 Ccnyl1定位在細(xì)胞膜上67-68
• 2.2.5 Ccnyl1基因敲除小鼠構(gòu)建及鑒定68-69
• 2.2.6 Ccnyl1敲除小鼠表現(xiàn)為雄性不育69-71
• 2.2.7 Ccnyl1-/-小鼠體重和生殖器官重量正常71-72
• 2.2.8 Ccnyl1基因敲除小鼠的雄性激素水平正常72-73
• 2.2.9 Ccnyl1不影響精子發(fā)生73-74
• 2.2.10 Ccnyl1-/-小鼠精子活力下降74-75
• 2.2.11 Ccnyl1-/-小鼠精子獲能正常和體外受精能力嚴(yán)重下降75-76
• 2.2.12 Ccnyl1-/-小鼠精子形態(tài)異常76-80
• 2.2.13 Ccnyl1不通過經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路發(fā)揮作用80-81
• 2.2.14 Cdk16在睪丸組織中特異高表達(dá),Ccnyl1缺失導(dǎo)致Cdk16蛋白水平下降81-83
• 2.2.15 Cdk16與Ccnyl1之間存在相互作用83-85
• 2.2.16 Ccnyll和CMkl6的相互作巧影響兩者的蛋白穩(wěn)定性85-87
• 2.2.17 Ccnyl1與Cdk16相互作用調(diào)節(jié)Cdk16磷酸化修飾及激酶活性87-92
• 2.3 結(jié)論與討論92-96
• 參考文獻(xiàn)96-108
• 附錄108-116
• 致謝116-118
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與取得的研究成果118

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6 李純錦;牛和人精子中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)及功能研究[D];吉林大學(xué);2010年

7 朱復(fù)希;圓頭精子癥受精失敗機(jī)理、對(duì)策及其基因診斷平臺(tái)的建立[D];中南大學(xué);2013年

8 崔險(xiǎn)峰;非梗阻性無(wú)精子癥睪丸外科取精及睪丸精子冷凍保存的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

9 周濤;人與獼猴精子發(fā)生相關(guān)蛋白質(zhì)組的生物信息學(xué)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2014年

10 李峰;精子介導(dǎo)的人凝血因子Ⅸ轉(zhuǎn)基因綿羊技術(shù)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2005年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 馬媛媛;綿羊Spesp1的cDNA克隆以及與其他精卵融合相關(guān)精子蛋白的相互作用[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

2 王海玲;莠去津?qū)有肪用富钚浴NA完整性及組蛋白表達(dá)的影響[D];河北大學(xué);2015年

3 丹彤;綿羊Izumo2的cDNA克隆、在睪丸和精子上的定位觀察及與其它精卵融合相關(guān)蛋白相互作用的初步篩選[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

4 田宇;低溫處理對(duì)豬精子泛素化水平及體外受精的影響[D];延邊大學(xué);2015年

5 楊向yN;冷凍技術(shù)對(duì)精子印記基因DNA甲基化及結(jié)構(gòu)影響的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

6 朱振東;褪黑色素對(duì)兔精子冷凍保存效果的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

7 陳鵬;小鼠精干細(xì)胞系和睪丸ECM體外3D培養(yǎng)體系的建立[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

8 范楚寧;半胱氨酸對(duì)獺兔精液冷凍保存效果的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

9 張妍;易感基因核苷酸多態(tài)性對(duì)中國(guó)漢族男性精子發(fā)生障礙的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

10 閆慧;小鼠精子發(fā)生過程中dysbindin-1的表達(dá)[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1128186