本文關鍵詞：隱孢子蟲和環(huán)孢子蟲的全基因組測序及其在分型工具建立中的應用

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【摘要】：隱孢子蟲(Cryptosporidium spp.)和環(huán)孢子蟲(Cyclospora spp.)是新發(fā)的食源性和水源性病原。每個屬內(nèi)均有多個蟲種/基因型。其中,大多數(shù)蟲種/基因型具有宿主特異性,但少數(shù)蟲種宿主范圍廣,為人獸共患蟲種。并且在同一蟲種內(nèi)部,不同分離株的毒力也有差異。但人們對蟲種宿主范圍差異、高毒力蟲株產(chǎn)生的原因、新發(fā)的感染人的蟲種的人獸共患性以及一些引起大規(guī)模暴發(fā)蟲種的地理隔離性并不清楚。為此,本文針對這些問題開展了如下研究：1.針對目前這兩個屬已經(jīng)測序的基因組少(隱孢子蟲)或無(環(huán)孢子蟲)是由于難以大量獲得純化病原和DNA的現(xiàn)狀,我們首先建立了一種可用于隱孢子蟲和環(huán)孢子蟲全基因組測序的DNA分離、富集和質控方法。該方法采用蔗糖密度梯度離心、氯化銫梯度離心以及免疫磁分離(隱孢子蟲)或流式細胞儀分選(環(huán)孢子蟲)相結合的方法對糞便樣品中的卵囊進行純化,之后采用全基因組擴增(WGA)對從純化卵囊中提取的DNA進行富集,最后采用qPCR和克隆Sanger測序的方法對WGA產(chǎn)物進行質控分析。通過對隱孢子蟲6個蟲種/基因型和卡耶塔環(huán)孢子蟲的共25份糞便樣品的WGA產(chǎn)物進行全基因組測序,證明了該方法的有效性。2.進一步采用以上方法,對人隱孢子蟲(Cryptosporidium hominis)中常引起暴發(fā)的高毒力蟲株(IbA10G2和IaA28R4的暴發(fā)株各兩個)進行了測序,并與已報道的低毒力蟲株(IaA25R3的TU502分離株)的基因組進行了比較,發(fā)現(xiàn)高毒力與低毒力蟲株在所有染色體上都有明顯的序列差異,但高毒力亞型分離株之間主要在6號染色體上有差異。進一步分析發(fā)現(xiàn)盡管在6號染色體的gp60位點(亞型區(qū)分位點)上,每個亞型都表現(xiàn)出各自亞型的特征,但在該位點之前和之后的位點,高毒力亞型常表現(xiàn)出其它亞型的特征,這表明遺傳重組可能是人隱孢子蟲高毒力亞型產(chǎn)生的遺傳基礎。3.由于人隱孢子蟲主要感染人,而微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)為隱孢子蟲屬中最主要的人獸共患蟲種,可感染人和反芻動物等,所以進一步對本課題中新測序的4個人隱孢子蟲的分離株和已報道的這兩個蟲種基因組進行了比較,發(fā)現(xiàn)盡管兩個蟲種的基因組有97%的相似度,但還是存在一些蟲種特異性基因。微小隱孢子蟲在3條染色體(5,6和8號)上都有蟲種特異性的基因,且這些基因都是屬于近端粒區(qū)的多拷貝家族,包括MEDLE家族和類胰島素酶。而人隱孢子蟲只在3號染色體上有一個蟲種特異性片段。這兩個蟲種基因組的高度相似性以及端粒區(qū)MEDLE家族和類胰島素酶基因拷貝數(shù)的不同,表明端粒基因的重復可能是導致微小隱孢子蟲宿主范圍擴大的原因。4.隱孢子蟲花栗鼠基因型I(Cryptosporidium chipmunk genotype Ⅰ)近年來在一些感染人的散發(fā)病例中被報道,但該基因型此前主要發(fā)現(xiàn)于嚙齒類動物中,也偶爾在水源中被檢出。為了解該該基因的人獸共患性,本課題在對該蟲種測序的基礎上,從其基因組中篩選出了gp60基因和mucm基因,建立了亞型區(qū)分方法,并對32個人源、野生動物源和水源的分離株進行了亞型區(qū)分,發(fā)現(xiàn)了15個gp60亞型,而且它們均屬于同一家族。發(fā)現(xiàn)了2個mucin亞型,二者也僅相差一個重復序列的拷貝。人源和動物源分離株的遺傳相似性說明該基因型具有人獸共患性。因此,該基因型感染人有可能是源于嚙齒動物,并通過水源性途徑進行傳播。5.卡耶塔環(huán)孢子蟲(Cyclospora cayetanensis)是環(huán)孢子蟲屬中唯一可感染人的蟲種,該蟲種近年來已引起了多起食源性暴發(fā)。為了建立可用于溯源的分子工具,本課題首先對來自我國的一個分離株進行了全基因組測序,進一步篩選出5個多態(tài)性的位點,建立了具有高分辨率的多位點序列分型(MLST)工具。采用該工具對來自多個國家的64個樣品進行分型,鑒定出了25個多位點序列類型(MLSTs),并發(fā)現(xiàn)這些MLSTs之間存在地理隔離。因此,本課題中建立的MLST方法有望被用于該蟲種的地理來源追蹤。綜上,本課題建立了可用于隱孢子蟲和環(huán)孢子蟲全基因組測序的DNA的富集和質控方法,獲得的全基因數(shù)據(jù)提高了我們對隱孢子蟲宿主特異性和毒力差異的認識,同時還促進了高分辨率的分子溯源工具的建立。以上結果有助于了解隱孢子蟲和環(huán)孢子蟲的其它生物學特性,群體遺傳結構,以及其它難培養(yǎng)病原的測序,從而為隱孢子蟲病和環(huán)孢子蟲病的防控提供理論依據(jù)。
【關鍵詞】：隱孢子蟲 環(huán)孢子蟲 全基因組測序 亞型區(qū)分 多位點序列分型
【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 第1章 文獻綜述15-40
• 1.1 隱孢子蟲和環(huán)孢子蟲概述15-23
• 1.1.1 臨床癥狀和易感人群15-16
• 1.1.2 隱孢子蟲和環(huán)孢子蟲在我國人群中的分布16-17
• 1.1.3 主要的傳播途徑和感染來源17-20
• 1.1.4 對公共衛(wèi)生的影響及防控策略20-23
• 1.2 隱孢子蟲和環(huán)孢子蟲的生物學特性23-29
• 1.2.1 隱孢子蟲的分類學地位、形態(tài)和生活史23
• 1.2.2 環(huán)孢子蟲的分類學地位、形態(tài)和生活史23-26
• 1.2.3 隱孢子蟲的蟲種和基因型26-28
• 1.2.4 環(huán)孢子蟲的蟲種和基因型28-29
• 1.3 隱孢子蟲和環(huán)孢子蟲的卵囊分離純化技術29-32
• 1.3.1 漂浮法30
• 1.3.2 密度梯度離心30-31
• 1.3.3 免疫磁分離法31
• 1.3.4 流式細胞儀技術31-32
• 1.4 隱孢子蟲和環(huán)孢子蟲分子流行病學檢測和分型工具32-35
• 1.4.1 基于隱孢子蟲和環(huán)孢子蟲的SSU rRNA基因的分子診斷工具32-33
• 1.4.2 基于隱孢子蟲和環(huán)孢子蟲的內(nèi)轉錄間隔區(qū)的分子診斷工具33-34
• 1.4.3 基于隱孢子蟲的gp60基因的分子診斷工具34
• 1.4.4 基于隱孢子蟲的微衛(wèi)星和小衛(wèi)星序列的多位點序列分型工具34-35
• 1.5 隱孢子蟲基因組學研究進展35-38
• 1.5.1 微小隱孢子蟲和人隱孢子蟲的基因組36
• 1.5.2 微小隱孢子蟲和人隱孢子蟲的比較基因組學研究36-38
• 1.6 本課題主要的研究內(nèi)容和意義38-40
• 第2章 用于全基因組測序的隱孢子蟲基因組DNA的分離、富集和質控方法40-55
• 2.1 引言40
• 2.2 實驗材料40-45
• 2.2.1 樣品采集40-41
• 2.2.2 實驗儀器41-44
• 2.2.3 實驗試劑44
• 2.2.4 數(shù)據(jù)分析軟件44-45
• 2.3 實驗方法45-49
• 2.3.1 卵囊純化45
• 2.3.2 DNA提取和全基因組擴增45-46
• 2.3.3 檢驗WGA產(chǎn)物中隱孢子蟲基因組含量46-47
• 2.3.4 檢驗WGA產(chǎn)物中隱孢子蟲基因組DNA的純度47-49
• 2.3.5 采用第二代測序技術對WGA產(chǎn)物進行全基因組測序49
• 2.4 實驗結果49-52
• 2.4.1 全基因組擴增的效率49-50
• 2.4.2 采用克隆-Sanger測序法檢測WGA產(chǎn)物的純度50-51
• 2.4.3 采用第二代測序技術檢測WGA產(chǎn)物的純度51
• 2.4.4 WGA產(chǎn)物的基因組覆蓋度51-52
• 2.5 討論52-53
• 2.6 本章小結53-55
• 第3章 比較基因組學分析揭示人隱孢子蟲高毒力亞型產(chǎn)生的遺傳基礎以及微小隱孢子蟲廣宿主的可能原因55-79
• 3.1 引言55
• 3.2 材料和方法55-56
• 3.2.1 樣品采集55-56
• 3.2.2 實驗儀器56
• 3.2.3 實驗試劑56
• 3.2.4 數(shù)據(jù)分析軟件56
• 3.3 實驗方法56-60
• 3.3.1 卵囊純化和全基因組擴增56
• 3.3.2 全基因組擴增產(chǎn)物的質量控制56
• 3.3.3 全基因組測序56
• 3.3.4 比較基因組學分析56-57
• 3.3.5 PCR驗證57-60
• 3.4 實驗結果60-76
• 3.4.1 人隱孢子蟲的全基因組測序數(shù)據(jù)以及從頭拼接60
• 3.4.2 測序基因組的覆蓋度60
• 3.4.3 人隱孢子蟲的基因組與微小隱孢子蟲Iowa分離株的基因組的序列相似度及其物理結構特征60-68
• 3.4.4 微小隱孢子蟲和人隱孢子蟲特異性的序列68-71
• 3.4.5 與已報道的人隱孢子蟲TU502分離株基因組的序列相似度71
• 3.4.6 人隱孢子蟲高毒力亞型的基因組之間的序列相似性以及遺傳重組的出現(xiàn)71-73
• 3.4.7 gp60位點重復序列區(qū)的樣品內(nèi)序列多樣性73-76
• 3.5 討論76-78
• 3.5.1 微小隱孢子蟲和人隱孢子蟲的基因組之間的相似性、基因的缺失和種特異性基因76-77
• 3.5.2 人隱孢子蟲基因組間的序列相似性以及高毒力的人隱孢子蟲亞型中的遺傳重組77-78
• 3.6 本章小結78-79
• 第4章 隱孢子蟲花栗鼠基因型Ⅰ的亞型區(qū)分工具的建立79-89
• 4.1 引言79
• 4.2 實驗材料79-80
• 4.2.1 樣品采集79
• 4.2.2 實驗儀器79-80
• 4.2.3 實驗試劑80
• 4.2.4 數(shù)據(jù)分析軟件80
• 4.3 實驗方法80-82
• 4.3.1 卵囊純化和全基因組擴增80
• 4.3.2 全基因組擴增產(chǎn)物的質量控制80
• 4.3.3 全基因組測序80
• 4.3.4 gp60基因和cgd1_470 mucin基因的PCR80
• 4.3.5 PCR擴增產(chǎn)物檢驗80
• 4.3.6 PCR擴增產(chǎn)物測序80-82
• 4.3.7 PCR產(chǎn)物序列分析82
• 4.4 實驗結果82-86
• 4.4.1 全基因組測序數(shù)據(jù)82
• 4.4.2 gp60基因特性82-84
• 4.4.3 gp60基因和cgd1_470 mucin基因的PCR擴增效率84
• 4.4.4 gp60亞型和mucin亞型84
• 4.4.5 gp60亞型間的進化關系84-86
• 4.5 討論86-88
• 4.6 本章小結88-89
• 第5章 環(huán)孢子蟲全基因組測序以及多位點序列分型方法的建立89-104
• 5.1 引言89
• 5.2 實驗材料89-91
• 5.2.1 樣品采集89-90
• 5.2.2 實驗儀器90-91
• 5.2.3 實驗試劑91
• 5.2.4 數(shù)據(jù)分析軟件91
• 5.3 實驗方法91-95
• 5.3.1 卵囊純化91-92
• 5.3.2 卵囊DNA提取和全基因組擴增92
• 5.3.3 檢驗全基因擴增產(chǎn)物中環(huán)孢子蟲基因組的含量92-93
• 5.3.4 檢驗WGA產(chǎn)物中環(huán)孢子蟲基因組DNA的純度93
• 5.3.5 全基因組測序93
• 5.3.6 微衛(wèi)星和小衛(wèi)星位點的PCR檢測93
• 5.3.7 PCR產(chǎn)物檢驗93
• 5.3.8 PCR產(chǎn)物測序93
• 5.3.9 PCR產(chǎn)物序列分析93-95
• 5.4 實驗結果95-102
• 5.4.1 全基因組擴增的效率95
• 5.4.2 卡耶塔環(huán)孢子蟲的全基因組序列95-96
• 5.4.3 微衛(wèi)星和小衛(wèi)星序列的初篩96
• 5.4.4 初篩的遺傳位點的擴增效率96
• 5.4.5 多態(tài)性遺傳位點的擴增效率96
• 5.4.6 多態(tài)性位點的序列特征96-98
• 5.4.7 5個位點上不同序列類型之間的系統(tǒng)進化關系98-101
• 5.4.8 多位點序列類型101-102
• 5.5 討論102-103
• 5.6 本章小結103-104
• 第6章 結論和創(chuàng)新點104-106
• 6.1 主要結論104
• 6.2 創(chuàng)新點104
• 6.3 展望104-106
• 參考文獻106-128
• 攻讀博士學位期間的研究成果128-129
• 致謝12

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中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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1 郭亞瓊;隱孢子蟲和環(huán)孢子蟲的全基因組測序及其在分型工具建立中的應用[D];華東理工大學;2015年

2 肖淑敏;牛源環(huán)孢子蟲與賈第蟲的分子特性與檢測研究[D];華南農(nóng)業(yè)大學;2006年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 李俊強;人、牛環(huán)孢子蟲病流行病學調查及分子生物學研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學;2014年

2 叢湄湄;陜西省圈養(yǎng)野生動物腸道寄生蟲感染情況調查及其環(huán)孢子蟲、隱孢子蟲種鑒定[D];西北農(nóng)林科技大學;2013年

3 曹智高;鄭州地區(qū)醫(yī)院病人環(huán)孢子蟲病流行病學調查及分子遺傳特性初步研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學;2010年

4 孫芳芳;河南省鄭汴地區(qū)水果、蔬菜表面主要腸道原蟲攜帶情況調查[D];河南農(nóng)業(yè)大學;2014年

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