本文關(guān)鍵詞：紅尾沙蜥適應(yīng)低氧環(huán)境的生理和生化機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 沙蜥屬 青藏高原 紅尾沙蜥 低氧適應(yīng) 低氧誘導(dǎo)因子 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 肌紅蛋白 一氧化氮合酶 一氧化氮

【摘要】：紅尾沙蜥(Phrynocephalus erythrurus)是世界上垂直分布最高的爬行動(dòng)物,棲息于青藏高原北部海拔4500-5300m之間。青藏高原平均海拔4000m以上,是全世界最高的高原,低氧和寒冷是其主要的環(huán)境特征。在這樣嚴(yán)酷的環(huán)境下,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇,世居高原的動(dòng)物表現(xiàn)出了一系列對(duì)高原環(huán)境獨(dú)特的適應(yīng)特征。本學(xué)位論文選用紅尾沙蜥及低海拔分布的同屬荒漠沙蜥(Phrynocephalus przewalskii)為研究對(duì)象,采用生理生化和分子生物學(xué)的方法從種間比較分析了兩種沙蜥的心肺結(jié)構(gòu)、心肌和骨骼肌毛細(xì)血管密度、肌紅蛋白濃度、一氧化氮合酶活性和一氧化氮(NO)含量等方面的差異以及與低氧調(diào)控相關(guān)的基因如低氧誘導(dǎo)因子(HIFs)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-A)、肌紅蛋白(Mb)、氧化氮合酶(NOSs)的表達(dá)情況來(lái)探究紅尾沙蜥對(duì)高海拔低氧環(huán)境的適應(yīng)特征。主要研究結(jié)果如下：與荒漠沙蜥相比,紅尾沙蜥肺部毛細(xì)血管分支節(jié)點(diǎn)更多,毛細(xì)血管網(wǎng)孔更小,呈現(xiàn)規(guī)律性“正多邊形”排列；同時(shí),紅尾沙蜥肺內(nèi)部還具有更多獨(dú)特的蜂窩狀氣室結(jié)構(gòu),這種構(gòu)筑形式有效增大了毛細(xì)血管與肺泡的接觸面積。由此可見(jiàn),紅尾沙蜥具有更復(fù)雜的肺部結(jié)構(gòu)和更大的肺內(nèi)表面積,這可能是紅尾沙蜥提高氣體交換效率的一種策略。與荒漠沙蜥相比,紅尾沙蜥心肌和骨骼肌毛細(xì)血管分布更為豐富。組織毛細(xì)血管的增加是紅尾沙蜥對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)特征之一,有利于血液和組織細(xì)胞的氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)。低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和HIF-2α在機(jī)體低氧適應(yīng)過(guò)程中處于核心的調(diào)控地位,其下游靶基因VEGF-A的表達(dá)能夠促進(jìn)毛細(xì)血管的發(fā)生與形成。研究表明,低氧可以誘導(dǎo)上述基因的表達(dá)。但是在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),與低海拔荒漠沙蜥相比,紅尾沙蜥肺中HIF-1α和HIF-2α mRNA表達(dá)顯著降低,分別下降了50.3%和65.1%(P0.001)；心肌和骨骼肌中兩種基因的表達(dá)無(wú)種間差異。紅尾沙蜥心肌和骨骼肌中VEGF-A mRNA的表達(dá)也明顯低于荒漠沙蜥,肺中VEGF-AmRNA的表達(dá)兩種沙蜥間無(wú)明顯差異。這些結(jié)果表明紅尾沙蜥中上述基因的表達(dá)不僅存在明顯的組織特異性而且還具有獨(dú)特的低氧響應(yīng)鈍化特征。與荒漠沙蜥相比,紅尾沙蜥肺、心肌和骨骼肌毛細(xì)血管密度增加,但其調(diào)控基因VEGF-AmRNA表達(dá)水平并未上調(diào),這可能是因?yàn)閂EGF-A在紅尾沙蜥中存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),紅尾沙蜥和荒漠沙蜥不同組織中HIF-1α、HIF-2αc和VEGF-A mRNA表達(dá)量之間并無(wú)一致的正相關(guān)性,這可能與上述基因均存在多重調(diào)控有關(guān)。另外,兩種沙蜥HIF-1α、HIF-2α和VEGF-A編碼區(qū)序列均出現(xiàn)氨基酸位點(diǎn)替換,這是否與高海拔環(huán)境適應(yīng)有關(guān)還有待于進(jìn)一步研究。Mb是重要的氧貯存和運(yùn)輸?shù)鞍?低氧條件下在細(xì)胞供氧過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本論文通過(guò)RACE-PCR克隆了紅尾沙蜥和荒漠沙蜥Mb基因序列全長(zhǎng),比對(duì)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)氨基酸位點(diǎn)替換,分別為Thr13Ile、Lys87Thr 和 His118Asn。通過(guò)同源建模分析兩種沙蜥肌紅蛋白三維空間結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),紅尾沙蜥肌紅蛋白heme pocket體積比荒漠沙蜥更大,這意味著更小的空間位阻,有利于氧氣的結(jié)合和卸載。同時(shí),紅尾沙蜥心肌和骨骼肌中Mb mRNA的表達(dá)均明顯高于荒漠沙蜥,分別是其表達(dá)量的2.4倍和3.1倍。紅尾沙蜥骨骼肌Mb濃度也明顯高于荒漠沙蜥,但心肌中無(wú)顯著差異。另外,我們還發(fā)現(xiàn)兩種沙蜥心肌中Mb mRNA表達(dá)量和蛋白濃度均約為骨骼肌中的2倍。上述結(jié)果與大多數(shù)動(dòng)物中Mb低氧適應(yīng)機(jī)制的研究結(jié)論一致。這些結(jié)果說(shuō)明紅尾沙蜥也采取了這一適應(yīng)策略,利用較高的肌紅蛋白來(lái)提高組織的供氧效率。NO是調(diào)節(jié)血管張力和結(jié)構(gòu)最重要的內(nèi)源性舒張因子,主要來(lái)源于L-Arg催化反應(yīng)。該反應(yīng)的唯一關(guān)鍵酶是一氧化氮合酶(NOS),主要有eNOS、nNOS和iNOS三種亞型。與荒漠沙蜥相比,紅尾沙蜥心肌、肺和骨骼肌中eNOS mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。紅尾沙蜥心肌和骨骼肌中nNOS mRNA表達(dá)水平顯著高于荒漠沙蜥,分別增加了248.9%和119.2%。肺中nNOS mRNA表達(dá)兩種沙蜥沒(méi)有差異。紅尾沙蜥心肌iNOS mRNA表達(dá)顯著高于荒漠沙蜥,約為其4.1倍。肺和骨骼肌中iNOS mRNA表達(dá)兩種沙蜥無(wú)顯著差異。與荒漠沙蜥相比,紅尾沙蜥骨骼肌中總NOS酶活性明顯下降而其他組織中沒(méi)有差異。紅尾沙蜥心肌和骨骼肌中iNOS酶活性顯著低于荒漠沙蜥,分別下降了66.9%和46.7%。血清和肺中iNOS酶活性未表現(xiàn)出種間差異。紅尾沙蜥血清、肺、心肌和骨骼肌中NO含量均顯著低于荒漠沙蜥。這些結(jié)果表明紅尾沙蜥心肌和骨骼肌中nNOS和iNOS mRNA的表達(dá)是選擇性上調(diào)的,但其心肌和骨骼肌中iNOS酶活性卻受到了抑制。我們推測(cè)這些特征可能與紅尾沙蜥長(zhǎng)期高海拔棲息地低氧環(huán)境有關(guān),也是其重要的適應(yīng)特征之一綜上所述,作者認(rèn)為紅尾沙蜥在心肺結(jié)構(gòu)和脈管系統(tǒng)及與低氧調(diào)控相關(guān)的基因表達(dá)等方面均表現(xiàn)出了一系列獨(dú)特的生理和生化適應(yīng)特征及分子調(diào)控機(jī)制,這些研究進(jìn)一步豐富和完善了高原低氧適應(yīng)機(jī)制研究的理論體系,有助于更好的保護(hù)高原生物多樣性,同時(shí)也為高原醫(yī)學(xué)研究和發(fā)展提供了參考。
【關(guān)鍵詞】：沙蜥屬 青藏高原 紅尾沙蜥 低氧適應(yīng) 低氧誘導(dǎo)因子 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 肌紅蛋白 一氧化氮合酶 一氧化氮
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q494
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-14
• 第一章 陸棲脊椎動(dòng)物高原適應(yīng)研究概況14-23
• 1.1 呼吸系統(tǒng)對(duì)低氧的適應(yīng)15-16
• 1.1.1 肺通氣響應(yīng)15-16
• 1.1.2 肺結(jié)構(gòu)的改變16
• 1.2 心臟對(duì)低氧的適應(yīng)16
• 1.3 氧運(yùn)輸系統(tǒng)16-17
• 1.4 代謝強(qiáng)度和酶活性對(duì)低氧的適應(yīng)17-18
• 1.5 低氧響應(yīng)基因的表達(dá)變化及調(diào)控18-23
• 1.5.1 低氧誘導(dǎo)因子19-20
• 1.5.2 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子20-22
• 1.5.3 促紅細(xì)胞生成素22
• 1.5.4 一氧化氮合酶22-23
• 第二章 青藏高原沙蜥屬蜥蜴研究概況23-26
• 2.1 中國(guó)沙蜥屬研究概述23-24
• 2.2 青藏高原沙蜥屬蜥蜴研究24-26
• 第三章 紅尾沙蜥心肺、脈管系統(tǒng)對(duì)高海拔低氧的生理適應(yīng)26-39
• 3.1 引言26
• 3.2 材料26-29
• 3.2.1 樣本采集26-27
• 3.2.2 主要試劑及配制27-29
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法29-31
• 3.3.1 肺組織顯微結(jié)構(gòu)29
• 3.3.2 心肌和骨骼肌毛細(xì)血管密度29-30
• 3.3.3 數(shù)據(jù)分析30-31
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-37
• 3.4.1 心肺重量和心肺重量與體重比31-32
• 3.4.2 肺組織顯微結(jié)構(gòu)觀察32-34
• 3.4.3 心肌毛細(xì)血管密度34
• 3.4.4 骨骼肌毛細(xì)血管密度34-37
• 3.5 討論37-39
• 第四章 紅尾沙蜥HIFs和VEGF-A基因克隆及mRNA表達(dá)研究39-71
• 4.1 引言39
• 4.2 樣品采集39-40
• 4.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑40-42
• 4.3.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器40
• 4.3.2 主要試劑40-41
• 4.3.3 主要溶液配制41-42
• 4.3.4 主要分析軟件和在線分析程序42
• 4.4 實(shí)驗(yàn)方法42-52
• 4.4.1 紅尾沙蜥和荒漠沙蜥組織總RNA提取42-43
• 4.4.2 去除總RNA中的基因組DNA43
• 4.4.3 RT-PCR cDNA第一鏈合成43-44
• 4.4.4 RACE-PCR cDNA合成44
• 4.4.5 紅尾沙蜥HIF-1和VEGF-A基因序列擴(kuò)增44-50
• 4.4.6 Real-time PCR50-52
• 4.5 結(jié)果52-67
• 4.5.1 不同組織總RNA提取52-53
• 4.5.2 HIF-1α和HIF-2α RT-PCR擴(kuò)增53
• 4.5.3 HIF-1α和HIF-2α RACE-PCR擴(kuò)增53-54
• 4.5.4 HIF-1α和HIF-2α cDNA序列生物信息學(xué)分析54-62
• 4.5.5 VEGF-A基因RT-PCR擴(kuò)增62
• 4.5.6 VEGF-A cDNA序列生物信息學(xué)分析62-65
• 4.5.7 Real-time PCR內(nèi)參基因的選擇65
• 4.5.8 不同組織HIF-1α、HIF-2α和VEGF-A mRNA表達(dá)65-67
• 4.5.9 HIF-1α、HIF-2α和VEGF-A mRNA表達(dá)相關(guān)性分析67
• 4.6 討論67-71
• 第五章 紅尾沙蜥肌紅蛋白對(duì)高原低氧的適應(yīng)71-87
• 5.1 引言71
• 5.2 樣品采集71
• 5.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑71
• 5.4 實(shí)驗(yàn)方法71-73
• 5.4.1 肌紅蛋白R(shí)T-PCR及RACE-PCR71-72
• 5.4.2 肌紅蛋白序列分析72-73
• 5.4.3 肌紅蛋白三維空間結(jié)構(gòu)及同源建模評(píng)估73
• 5.4.4 肌紅蛋白mRNA的表達(dá)73
• 5.4.5 肌紅蛋白濃度的測(cè)定73
• 5.5 結(jié)果73-83
• 5.5.1 肌紅蛋白R(shí)T-PCR和RACE-PCR73-74
• 5.5.2 肌紅蛋白cDNA全長(zhǎng)序列分析74-76
• 5.5.3 肌紅蛋白氨基酸序列分析76-79
• 5.5.4 肌紅蛋白三維空間結(jié)構(gòu)與同源建模評(píng)估79-82
• 5.5.5 肌紅蛋白mRNA表達(dá)82
• 5.5.6 肌紅蛋白濃度82-83
• 5.6 討論83-87
• 第六章 紅尾沙蜥一氧化氮含量及一氧化氮合酶對(duì)高原低氧的適應(yīng)87-104
• 6.1 引言87
• 6.2 樣品采集87
• 6.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑87
• 6.4 方法87-94
• 6.4.1 RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄87-88
• 6.4.2 eNOS、nNOS和iNOS基因的克隆88-89
• 6.4.3 eNOS,nNOS和iNOS Real-time PCR89-90
• 6.4.4 NOS酶活測(cè)定90-92
• 6.4.5 NO含量測(cè)定92-93
• 6.4.6 組織蛋白濃度的測(cè)定93-94
• 6.4.7 數(shù)據(jù)分析94
• 6.5 結(jié)果94-100
• 6.5.1 NOSs基因RT-PCR及序列分析94-96
• 6.5.2 兩種沙蜥不同組織中eNOS、nNOS和iNOS mRNA表達(dá)水平96-98
• 6.5.3 iNOS和總NOS酶活性測(cè)定98-99
• 6.5.4 NO含量99-100
• 6.6 討論100-104
• 6.6.1 長(zhǎng)期的高原低氧適應(yīng)增加了紅尾沙蜥nNOS和iNOS mRNA的表達(dá)100-101
• 6.6.2 較低水平的iNOS酶活性是紅尾沙蜥適應(yīng)高原低氧環(huán)境的策略之一101-102
• 6.6.3 紅尾沙蜥NO含量與長(zhǎng)期的高原低氧適應(yīng)間的關(guān)系102-104
• 第七章 結(jié)論與創(chuàng)新104-106
• 7.1 主要結(jié)論104-105
• 7.2 創(chuàng)新點(diǎn)105-106
• 參考文獻(xiàn)106-119
• 在讀期間發(fā)表論文情況119-120
• 學(xué)術(shù)交流與獲獎(jiǎng)情況120-121
• 學(xué)術(shù)交流120
• 獲獎(jiǎng)情況120-121
• 參與科研項(xiàng)目121-122
• 致謝122-124
• 附錄124-151

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王寧波;紅尾沙蜥和荒漠沙蜥體溫調(diào)節(jié)的比較研究[D];蘭州大學(xué);2013年

本文編號(hào)：1041074