本文關鍵詞：基于微流控芯片的蛋白質高靈敏快速檢測技術研究

  更多相關文章： 微流控芯片 溫度敏感聚合物 硼酸親和 膠體金免疫層析試紙條 富集 快速檢測

【摘要】：如何從種類繁多、成分復雜且含量較低的生物樣品中實現目標蛋白的高靈敏快速檢測,一直以來都是分析工作者所追求并致力解決的科學問題之一。目前發(fā)展的多種大型檢測設備可以用于蛋白質的高效、準確、靈敏的檢測,但尚不能滿足目前環(huán)境監(jiān)測、食品安全、醫(yī)療衛(wèi)生、毒品檢測等領域所追求的實時、快速檢測的需求。微流控芯片已經發(fā)展成為一種極具潛力的分析平臺,它可以與實驗室中的生物技術與分析方法,如樣品的取樣、前處理、反應、富集分離、檢測等進行集成,最終形成一種具有操作簡單、便于攜帶、實時、高通量檢測特點的快速現場檢測方法。本論文以微流控芯片技術為手段,重點研究:(1)通道內壁修飾方法。通過減少蛋白質的非特異性吸附,提高蛋白質的檢測靈敏度。(2)發(fā)展了兩種新型溫度敏感硼酸親和特性的微流控芯片。通過簡單的調節(jié)溫度,實現樣品蛋白的快速捕獲與釋放,進而提高檢測的靈敏度。(3)基于膠體金免疫色譜技術,發(fā)展了一種新型的膠體金免疫色譜微流控芯片,實現了蛋白質的快速、連續(xù)、可視化、便攜檢測。主要研究內容包括以下幾個方面:1.發(fā)展了一種通道內壁簡單的涂層技術,抑制蛋白質的非特異性吸附。為了實現微流控芯片對蛋白質樣品的高靈敏檢測,制備了一種新型、簡單的微流控芯片涂層方法—牛血清白蛋白(BSA)涂層,以降低目標蛋白的非特異性吸附,提高檢測靈敏度。由于毛細管和玻璃芯片的材質是相同的,并且可以直接以堿性蛋白為研究對象,所以采用毛細管電泳儀(UV檢測器)來表征其涂層效果。經過優(yōu)化,其最佳的涂層條件為:磷酸鹽緩沖液的pH值為4.2,涂層靜置時間為12 h,涂層BSA濃度為1.5 mg/mL。利用這種涂層的毛細管,實現了核糖核酸酶、溶菌酶、胰蛋白酶和肌紅蛋白四中堿性蛋白混合物的分離。最后,將這種涂層方法應用到微流控芯片中。這種涂層方法的涂層過程簡單、快速,并且涂層具有良好的穩(wěn)定性和重現性。2.制備了一種基于P(NIPAAm-co-AAPBA)的溫度敏感親和PDMS微流控芯片,實現了對目標樣品的選擇性富集分離。通過UV誘導的接枝聚合反應,在PDMS微流控芯片中接枝了P(NIPAAm-co-AAPBA),通過調節(jié)溫度而不改變流動相的p H值,來捕獲和釋放樣品中含有順式二羥基的生物分子,如腺苷、糖蛋白、酶等。通過調節(jié)溫度從4℃到55℃,P(NIPAAm-co-AAPBA)接枝的PDMS微芯片成功用于含有順式二羥基的腺苷分子的捕獲與釋放。經過進一步的發(fā)展,構建的PDMS微流控芯片可以作為一種潛在的工具,用于順式二羥基生物分子如:辣根過氧化物酶和糖蛋白等樣品的捕獲與釋放。3.制備了一種基于P(NIPAAmco-VPBA)的溫度敏感親和玻璃微流控芯片,實現對目標蛋白質的選擇性富集分離。通過表面引發(fā)原子轉移自由基聚合反應(SI-ATRP),在玻璃微流控芯片的表面成功接枝了P(NIPAAmco-VPBA),制備了一種具有溫度響應硼酸親和效應的微流控芯片。通過簡單的溫度調節(jié)(從4℃到55℃),接枝有P(NIPAAmco-VPBA)聚合物的微流控芯片,可以專一性、選擇性的從腺苷和脫氧腺苷混合物中,快速實現順式二羥基生物分子腺苷的捕獲與釋放,從進樣到樣品的收集總共需要不到10 min。這種P(NIPAAmco-VPBA)聚合物接枝的微流控芯片會成為一種潛在的工具,用于高選擇性和重現性的對含有順式二羥基的生物分子如糖蛋白、糖類、糖基化肽段、核酸等的富集。4.制備了一種膠體金免疫色譜試紙條和膠體金免疫色譜微流控芯片,實現了IL-6和TNF-α的連續(xù)、快速、可視化檢測。酶聯免疫吸附實驗(ELISA)是檢測白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)最常用的方法。然而,這種方法耗時,并且需要消耗大量的樣品。與ELISA相比較,膠體金免疫色譜試紙條,由于具有檢測速度快,靈敏度高,專一性強,處理方法簡單,適用于多種樣品的檢測,需要的樣品量少,可以長時間存放,價格便宜和不需要高端技術的儀器等優(yōu)點。因此本論文制備了一種膠體金免疫色譜試紙條和膠體金免疫色譜微芯片用于連續(xù)、快速、可視化檢測IL-6和TNF-α,其最低檢測限分別為62.5 ng/mL和30 ng/mL。在不使用任何儀器的條件下,利用這種膠體金免疫色譜試紙條和微芯片可以簡單、高效、快速實現目標蛋白質的檢測。
【關鍵詞】：微流控芯片 溫度敏感聚合物 硼酸親和 膠體金免疫層析試紙條 富集 快速檢測
【學位授予單位】：北京理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TQ937
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第1章 緒論14-36
• 1.1 微流控芯片14-16
• 1.1.1 微流控芯片技術14
• 1.1.2 微流控芯片內壁修飾14-16
• 1.2 微流控芯片富集技術16-23
• 1.2.1 基于吸附的固相萃取富集技術16-17
• 1.2.2 基于多孔濾膜的富集技術17-18
• 1.2.3 基于電驅動的富集技術18-19
• 1.2.4 基于溫度敏感硼酸親和材料的富集技術19-23
• 1.3 微流控芯片分析檢測技術23-25
• 1.3.1 微流控芯片電化學檢測23-24
• 1.3.2 微流控芯片熒光檢測24
• 1.3.3 微流控芯片化學發(fā)光檢測24-25
• 1.4 膠體金免疫層析試紙條25-33
• 1.4.1 膠體金納米顆粒及其性能25-26
• 1.4.2 膠體金免疫試紙條的結構及其檢測原理26-28
• 1.4.3 膠體金免疫試紙條的應用28-33
• 1.5 本論文的主要研究內容及選題意義33-36
• 第2章 基于涂層改性的蛋白質微流控芯片檢測方法研究36-49
• 2.1 試劑耗材37-39
• 2.1.1 實驗試劑37
• 2.1.2 實驗儀器與耗材37-38
• 2.1.3 試劑配制38-39
• 2.2 實驗方法39-40
• 2.2.1 毛細管涂層過程39
• 2.2.2 毛細管電泳系統39-40
• 2.3 結果與討論40-48
• 2.3.1 最佳的涂層緩沖液pH和涂層BSA濃度的優(yōu)化40-43
• 2.3.2 BSA涂層靜置時間長短的優(yōu)化43-44
• 2.3.3 毛細管內壁涂層的穩(wěn)定性考察44-45
• 2.3.4 涂層毛細管的重現性45
• 2.3.5 涂層毛細管對蛋白質的分離45-47
• 2.3.6 BSA涂層在微流控芯片中的應用47-48
• 2.4 小結48-49
• 第3章 基于P(NIPAAM-CO-AAPBA)的PDMS微流控芯片蛋白質富集技術49-66
• 3.1 試劑耗材49-51
• 3.1.1 實驗試劑49-50
• 3.1.2 實驗儀器與耗材50-51
• 3.1.3 試劑的配制51
• 3.2 實驗方法51-56
• 3.2.1 3-丙烯酰胺基苯硼酸（AAPBA）的合成51-52
• 3.2.2 P(NIPAAm-co-AAPBA)接枝的PDMS基片的制備52-53
• 3.2.3 P(NIPAAm-co-AAPBA)接枝的PDMS微流控芯片的制備53-56
• 3.3 結果與討論56-64
• 3.3.1 PDMS基片在二苯甲酮中的最佳浸泡時間的優(yōu)化56-57
• 3.3.2 接枝聚合反應中UV照射時間長短的優(yōu)化57-58
• 3.3.3 氯仿浸泡對PDMS基片表面接枝聚合的影響58-59
• 3.3.4 P(NIPAAm-co-AAPBA)接枝的PDMS基片表面的電鏡表征59-60
• 3.3.5 P(NIPAAm-co-AAPBA)接枝的PDMS基片表面水接觸角的測量60-61
• 3.3.6 P(NIPAAm-co-AAPBA)接枝的PDMS基片表面FTIR表征61-62
• 3.3.7 P(NIPAAm-co-AAPBA)接枝的PDMS微流控芯片用于捕獲與釋放腺苷分子62-64
• 3.4 小結64-66
• 第4章 基于P(NIPAAM-CO-VPBA)的玻璃微流控芯片蛋白質富集技術66-78
• 4.1 試劑耗材66-69
• 4.1.1 實驗試劑66-67
• 4.1.2 實驗儀器與耗材67-68
• 4.1.3 試劑的配制68-69
• 4.2 實驗方法69-72
• 4.2.1 玻璃基片的預處理69
• 4.2.2 APTES修飾的玻璃基片的制備69
• 4.2.3 2-溴異丁酰溴功能化的玻璃基片的制備69
• 4.2.4 玻璃基片表面原位原子轉移自由基聚合（SI-ATRP）反應69-70
• 4.2.5 溫度敏感硼酸親和微芯片的制備及其在腺苷的捕獲與釋放上的應用70-72
• 4.3 結果與討論72-77
• 4.3.1 FTIR表征72-73
• 4.3.2 X射線光電子能譜（XPS）元素分析73-76
• 4.3.3 熱響應型硼酸親和玻璃芯片對腺苷的捕獲和釋放76-77
• 4.4 小結77-78
• 第5章 基于膠體金免疫色譜試紙條及微芯片的蛋白質的快速、連續(xù)、可視化檢測78-106
• 5.1 試劑耗材82-84
• 5.1.1 實驗試劑82
• 5.1.2 實驗儀器與耗材82-83
• 5.1.3 試劑的配制83-84
• 5.2 實驗方法84-91
• 5.2.1 膠體金的制備84-85
• 5.2.2 膠體金的表征85
• 5.2.3 膠體金-抗體復合物的制備85-87
• 5.2.4 膠體金試紙條的制備及組裝87-90
• 5.2.5 膠體金免疫色譜微芯片的制備90-91
• 5.3 結果與討論91-104
• 5.3.1 膠體金的制備及電鏡表征91-92
• 5.3.2 膠體金的紫外表征92-93
• 5.3.3 膠體金制備的重現性考察93-94
• 5.3.4 膠體金-單克隆抗體復合物的制備94-96
• 5.3.5 膠體金溶液與單克隆抗體結合的表征96-97
• 5.3.6 膠體金-抗體復合物重懸緩沖液的優(yōu)化97-98
• 5.3.7 膠體金免疫色譜試紙條用于檢測人IL-698
• 5.3.8 膠體金免疫色譜試紙條用于檢測人TNF-α98-100
• 5.3.9 膠體金免疫色譜試紙條用于連續(xù)檢測IL-6 和TNF-α100-101
• 5.3.10 膠體金免疫色譜微芯片用于細胞炎癥因子的檢測101-104
• 5.4 小結104-106
• 結論106-108
• 參考文獻108-122
• 附錄122-126
• 攻讀學位期間發(fā)表論文與研究成果清單126-128
• 致謝128

【共引文獻】

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