本文關(guān)鍵詞：基于抗獨特型納米抗體的桔霉素綠色免疫分析的研究

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【摘要】：桔霉素(Citrinin,CIT)是由青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)和紅曲霉屬(Monascus)中的絲狀霉菌代謝產(chǎn)生的一種真菌毒素,對人和動物具有較強的毒性作用。廣泛存在于糧谷類及紅曲發(fā)酵制品等食物中。鑒于桔霉素在各類食品中的污染水平及居民膳食中的暴露量,部分國家已制定了紅曲制品中CIT的限量標(biāo)準(zhǔn)。目前,應(yīng)用于檢測CIT的方法主要包括薄層層析法、高效液相色譜法、免疫分析法以及電化學(xué)傳感器等。相比較而言,免疫分析法基于抗原抗體特異性識別,具有檢測靈敏度高、選擇性好、樣品前處理簡單、耗時短、成本低等優(yōu)勢。適合于食品安全監(jiān)測過程中的大樣本快速篩檢。然而該方法的建立與應(yīng)用,需使用大量CIT標(biāo)準(zhǔn)物及有機溶劑合成檢測抗原,同時還需CIT標(biāo)準(zhǔn)物建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,對操作人員的健康具有潛在的危害。若含有毒素標(biāo)準(zhǔn)物的廢液處理不當(dāng),還可能造成實驗室及環(huán)境的二次污染問題。本研究針對上述問題,將抗獨特型納米抗體應(yīng)用于CIT的分子模擬,研制出CIT替代抗原,并建立了CIT綠色免疫學(xué)分析技術(shù),降低了CIT對操作人員的危害及對環(huán)境造成的污染,為CIT污染的監(jiān)控提供了靈敏、快速、簡便、成本低、環(huán)保的新方法。本論文的主要研究內(nèi)容和創(chuàng)新點如下:1首次從羊駝天然納米抗體文庫中淘選獲得CIT替代抗原的抗獨特型納米抗體,研究建立了基于納米抗體替代抗原的免疫分析技術(shù),為其他小分子生物毒素等毒性污染物的綠色免疫分析研究提供了新的技術(shù)平臺。1.1 CIT噬菌體ELISA方法的建立(P-ELISA)。經(jīng)過四輪親和淘選,從羊駝天然納米抗體文庫中獲得一株可與CIT單克隆抗體4G6可變區(qū)特異性結(jié)合的納米抗體X27,并建立了噬菌體展示納米抗體作為替代競爭抗原的ELISA。對包被抗體濃度、噬菌體投入量、甲醇濃度、p H值、鹽離子濃度等參數(shù)的優(yōu)化后。該方法對CIT檢測的IC50值為10.9 ng/m L,線性范圍為2.5~100.0μg/kg,與常見真菌毒素黃曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)無交叉反應(yīng);對大米和面粉兩種空白樣品加標(biāo)回收率分別在82.0~100.3%和79.2~110.1%之間;對谷類樣品進(jìn)行檢測,與傳統(tǒng)ELISA比較,檢測結(jié)果一致。1.2基于納米抗體替代包被抗原ELISA方法的建立(V-ELISA)。對X27納米抗體進(jìn)行表達(dá)純化。該抗體可特異性結(jié)合CIT抗體4G6,與其他抗真菌毒素抗體無交叉反應(yīng);經(jīng)棋盤滴定優(yōu)化了納米抗體包被濃度和抗體工作濃度,建立了以X27納米抗體為包被抗原的V-ELISA方法,并對反應(yīng)體系的甲醇濃度進(jìn)行了優(yōu)化。該方法對CIT檢測的IC50值為44.6 ng/m L,線性范圍為5.0~300.0μg/kg,方法與四種常見真菌毒素(AFB1、OTA、ZEN、DON)無交叉反應(yīng);大米和面粉兩種空白樣品加標(biāo)回收率分別在82.7~101.5%和83.7~115.6%之間;分別采用V-ELISA與傳統(tǒng)ELISA對紅曲發(fā)酵大米樣品進(jìn)行檢測,兩種方法檢測結(jié)果一致,表明本研究建立的基于納米抗體替代包被抗原的ELISA方法可應(yīng)用于紅曲制品中CIT的污染監(jiān)測。1.3抗原抗體結(jié)合動力學(xué)參數(shù)的分析。采用生物薄膜光干涉技術(shù)(BLI)分別對X27納米抗體與CIT抗體4G6及CIT人工合成抗原與抗體的結(jié)合動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測定。CIT模擬抗原X27納米抗體與抗體的平衡解離常數(shù)KD值為160 n M,而CIT人工合成抗原的KD值為68 n M。基于CIT模擬抗原較低的親和力,V-ELISA展示出比傳統(tǒng)ELISA更高的靈敏度。2成功構(gòu)建雙峰駱駝天然納米抗體文庫,并將淘選獲得的不同親和力的抗獨特型納米抗體分別作為CIT標(biāo)準(zhǔn)物替代品和CIT包被抗原,研究建立了基于納米抗體的無毒免疫分析方法。2.1成功構(gòu)建雙峰駱駝天然納米文庫。提取未經(jīng)免疫的雙峰駱駝外周血淋巴細(xì)胞RNA,采用單域重鏈抗體鉸鏈區(qū)特異性引物,克隆獲得大小在500bp左右的重鏈可變區(qū)片段(VHH)。再將擴增得到的VHH片段連接到噬菌粒載體p HEN1上,電轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1,獲得庫容量為5.0×108的駱駝天然納米抗體基因文庫,經(jīng)M13K07輔助噬菌體救援獲得滴度為1.2×1013 c.f.u/m L的納米抗體噬菌體展示庫。2.2以抗CIT單克隆抗體4G6為靶標(biāo)進(jìn)行固相親和淘選。采用Gly-HCl(p H 2.2)洗脫法結(jié)合CIT標(biāo)準(zhǔn)物競爭洗脫法,對駱駝天然納米抗體親和淘選。獲得5種不同序列的克隆可與CIT競爭結(jié)合CIT單克隆抗體4G6。5種納米抗體展現(xiàn)出不同的親和力,其中C1與CIT抗體4G6的親和力最高,KD值為38.4 n M。此外,納米抗體C1在70℃下處理20 min仍保持良好活性,具有較高的熱穩(wěn)定性。2.3基于抗獨特型納米抗體的無毒ELISA方法的建立。以納米抗體A9為包被抗原,分別建立CIT標(biāo)準(zhǔn)物及納米抗體C1替代CIT標(biāo)準(zhǔn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同的抑制率下,納米抗體C1濃度與CIT標(biāo)準(zhǔn)物濃度具有良好的線性相關(guān),線性相關(guān)方程為y=49.404x-10.395(R2=0.9977),其中y為CIT濃度,x為納米抗體C1濃度。采用兩步法計算樣品中CIT含量,首先根據(jù)樣品檢測的抑制率計算替代標(biāo)準(zhǔn)物的納米抗體C1濃度,然后通過C1濃度與CIT的線性相關(guān)方程,再轉(zhuǎn)換為樣品中CIT含量。選取了8份紅曲發(fā)酵大米的樣品,采用無毒ELISA法進(jìn)行檢測,與高效液相色譜法檢測結(jié)果進(jìn)行比較,相關(guān)系數(shù)R2值為0.957。因此,本研究研制的基于抗獨特型納米抗體的綠色無毒ELISA能夠應(yīng)用于實際樣品中CIT污染的檢測。
【關(guān)鍵詞】：桔霉素 駱駝科 抗獨特型抗體 納米抗體 分子模擬 綠色免疫分析
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TS207.3;TB383.1
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-10
• 縮略語10-15
• 第1章 前言15-38
• 1.1 桔霉素免疫分析技術(shù)研究進(jìn)展15-21
• 1.1.1 桔霉素概述15-17
• 1.1.2 桔霉素免疫分析技術(shù)17-20
• 1.1.3 桔霉素免疫分析的發(fā)展趨勢20-21
• 1.2 綠色免疫分析技術(shù)研究進(jìn)展21-36
• 1.2.1 綠色免疫分析概述21-22
• 1.2.2 噬菌體隨機多肽展示技術(shù)22-23
• 1.2.3 噬菌體隨機多肽展示技術(shù)在抗原表位模擬中的應(yīng)用23-24
• 1.2.4 抗獨特型抗體24-28
• 1.2.5 納米抗體28-35
• 1.2.6 抗獨特型納米抗體35-36
• 1.3 主要研究內(nèi)容和意義36-38
• 1.3.1 研究內(nèi)容36
• 1.3.2 研究意義36-38
• 第2章 抗獨特型納米抗體替代抗原的綠色免疫分析研究38-70
• 2.1 材料、儀器與試劑38-41
• 2.1.1 主要材料38
• 2.1.2 主要儀器38-39
• 2.1.3 主要溶液和培養(yǎng)基39-41
• 2.2 方法與步驟41-49
• 2.2.1 羊駝天然納米抗體基因文庫噬菌粒的救援與滴度測定41
• 2.2.2 抗獨特型納米抗體的淘選與鑒定41-43
• 2.2.3 桔霉素Phage-ELISA(P-EILSA)的建立43-44
• 2.2.4 桔霉素P-ELISA的驗證44
• 2.2.5 抗獨特型納米抗體的表達(dá)與純化44-47
• 2.2.6 抗獨特型納米抗體替代CIT包被抗原V-ELISA的建立47
• 2.2.7 V-ELISA在實際樣品檢測的應(yīng)用47-48
• 2.2.8 抗獨特型納米抗體及CIT抗原與單克隆抗體 4G6的親和力48-49
• 2.3 結(jié)果與分析49-66
• 2.3.1 抗獨特型納米抗體的親和淘選49
• 2.3.2 陽性克隆的鑒定49-50
• 2.3.3 桔霉素phage-EISA(P-ELISA)的建立50-57
• 2.3.4 抗獨特型納米抗體的表達(dá)和純化57-59
• 2.3.5 抗獨特型納米抗體替代包被抗原ELISA（V-ELISA）的建立59-65
• 2.3.6 親和力分析65-66
• 2.4 討論66-69
• 2.4.1 抗獨特型納米抗體的制備66
• 2.4.2 納米抗體的原核表達(dá)66-67
• 2.4.3 基于抗獨特型納米抗體的CIT免疫分析方法67-68
• 2.4.4 抗獨特型納米抗體在小分子半抗原模擬研究中的優(yōu)勢68-69
• 2.5 小結(jié)69-70
• 第3章 抗獨特型納米抗體替代CIT標(biāo)準(zhǔn)物的綠色無毒免疫分析研究70-97
• 3.1 材料、儀器和試劑70-71
• 3.1.1 主要材料與試劑70
• 3.1.2 主要儀器70
• 3.1.3 主要溶液和培養(yǎng)基70-71
• 3.1.4 PCR引物71
• 3.2 方法與步驟71-78
• 3.2.1 駱駝天然納米抗體文庫的構(gòu)建71-76
• 3.2.2 抗獨特型納米抗體的淘選與鑒定76
• 3.2.3 抗獨特型納米抗體的表達(dá)純化76-77
• 3.2.4 抗獨特型納米抗體的驗證77
• 3.2.5 抗獨特型納米抗體與CIT單抗結(jié)合動力學(xué)分析77
• 3.2.6 抗獨特型納米抗體的熱穩(wěn)定性77
• 3.2.7 CIT無毒ELISA的建立77-78
• 3.2.8 實際樣品檢測的應(yīng)用78
• 3.3 結(jié)果與分析78-92
• 3.3.1 駱駝天然納米抗體文庫的構(gòu)建及鑒定78-81
• 3.3.2 抗獨特型納米抗體的親和淘選81-82
• 3.3.3 陽性克隆的鑒定82-84
• 3.3.4 陽性克隆P-ELISA檢測CIT競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立84
• 3.3.5 抗獨特型納米抗體的性質(zhì)鑒定84-86
• 3.3.6 抗獨特型納米抗體與CIT單抗親和力的分析86-88
• 3.3.7 抗獨特型納米抗體C1的熱穩(wěn)定性88
• 3.3.8 CIT無毒綠色免疫分析方法的建立88-91
• 3.3.9 方法在實際樣品檢測的應(yīng)用91-92
• 3.4 討論92-96
• 3.4.1 納米抗體基因文庫的構(gòu)建92-93
• 3.4.2 抗獨特型納米抗體的應(yīng)用93-94
• 3.4.3 抗原抗體親和力與競爭免疫分析方法靈敏度的關(guān)系94
• 3.4.4 納米抗體親和力的改造94-96
• 3.5 小結(jié)96-97
• 第4章 結(jié)論與展望97-100
• 4.1 結(jié)論97-98
• 4.2 展望98-100
• 參考文獻(xiàn)100-112
• 附錄A 氨基酸基本信息表112-113
• 致謝113-114
• 攻讀博士學(xué)位期間的研究成果114

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