發(fā)布時間：2017-08-30 15:01

  本文關(guān)鍵詞：釀酒酵母中β-香樹脂醇合成途徑的構(gòu)建與調(diào)控

  更多相關(guān)文章： β-香樹脂醇 三萜 合成生物學(xué) CRISPR/Cas9 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 釀酒酵母

【摘要】：β-香樹脂醇是一種五環(huán)三萜化合物,也是其它齊墩果烷型三萜如甘草次酸、大豆皂甙等生物合成的骨架,具有抗炎、抗細菌和真菌、抗病毒及癌細胞防治功效,在降血糖、降血脂方面也具有良好效果。與很多萜類相似,β-香樹脂醇在植物中的含量很低,化學(xué)合成收率不高,因而限制了其規(guī)�；a(chǎn)和廣泛應(yīng)用。為了提高β-香樹脂醇的生產(chǎn)能力,本文利用代謝工程和合成生物學(xué)方法在釀酒酵母中構(gòu)建其合成途徑,經(jīng)途徑和發(fā)酵過程優(yōu)化,實現(xiàn)β-香樹脂醇的高效合成。研究結(jié)果如下:首先將光果甘草β-香樹脂醇合酶基因進行密碼子優(yōu)化并采用質(zhì)粒表達,氣相色譜-質(zhì)譜分析證明在工程酵母SpKb中成功合成了β-香樹脂醇,產(chǎn)量為0.75±0.06 mg/L,單位細胞產(chǎn)量為0.07±0.02 mg/g DCW,為進一步通過途經(jīng)改造提高β-香樹脂醇生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)�；邗徬┨幱谌坪顽薮己铣赏緩椒种c的特點,以鯊烯庫存量為代謝途徑平衡點,設(shè)計了“推拉式”途徑優(yōu)化措施調(diào)控β-香樹脂醇合成。首先通過異源表達白色念珠菌鯊烯單加氧酶促進鯊烯向下游2,3-氧化鯊烯的轉(zhuǎn)化,然后過表達大腸桿菌IPP異構(gòu)酶、酵母自身FPP合酶和鯊烯合酶增強鯊烯供應(yīng),這種“推拉式”代謝策略使β-香樹脂醇產(chǎn)量達到36.50±1.99 mg/L,提高了49倍。依據(jù)轉(zhuǎn)錄因子UPC2全局調(diào)控機理,將UPC2的DNA結(jié)合位點序列(SRE序列)重構(gòu)于構(gòu)建途徑的ADH1p、ALA1p、GPM1p、TYS1p和FBA1p啟動子中,啟動子強度提高了42.2%~67.5%,強化了β-香樹脂醇合成途徑的整體表達效率,使其產(chǎn)量進一步提高到48.50±2.55 mg/L,在“推拉式”途徑優(yōu)化基礎(chǔ)上提高了32.9%。為了下調(diào)競爭β-香樹脂醇合成的內(nèi)源甾醇和乙酰輔酶A代謝分流,設(shè)計并構(gòu)建了CRISPR/dCas9系統(tǒng),對報告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄抑制研究發(fā)現(xiàn),gRNA的結(jié)構(gòu)是影響CRISPR/dCas9轉(zhuǎn)錄抑制效果的重要因素。進而設(shè)計了一步轉(zhuǎn)化、組裝多個gRNA進行多基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)的方法,成功將甾醇合成相關(guān)的羊毛甾醇合酶基因ERG7和乙酰輔酶A代謝相關(guān)的乙醇脫氫酶ADH1/4/5/6、檸檬酸合酶CIT2和蘋果酸合酶MLS2基因的7個gRNA實現(xiàn)了一步組裝,組裝效率達40%,7個基因的轉(zhuǎn)錄抑制率平均達75.5%,β-香樹脂醇產(chǎn)量比未下調(diào)內(nèi)源競爭代謝的對照菌提高了42.2%,表明CRISPR/dCas9系統(tǒng)在酵母途徑工程優(yōu)化應(yīng)用中的潛力。通過對工程菌發(fā)酵生產(chǎn)β-香樹脂醇的培養(yǎng)條件優(yōu)化,獲得最優(yōu)的初始pH為5.0、接種OD為0.30、初始葡萄糖濃度為35 g/L。采用乙醇補料批式發(fā)酵,使β-香樹脂醇的產(chǎn)量提高了90.2%。通過梯度補加甲基-β-環(huán)糊精,不僅實現(xiàn)了β-香樹脂醇向胞外的轉(zhuǎn)運,而且促進了β-香樹脂醇的合成,乙醇補料批式發(fā)酵方式下β-香樹脂醇的產(chǎn)量達到156.7±8.62 mg/L,單位細胞產(chǎn)量達18.44±1.91 mg/g DCW,分別比初始工程菌SpKb提高了209倍和263倍。
【關(guān)鍵詞】：β-香樹脂醇 三萜 合成生物學(xué) CRISPR/Cas9 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 釀酒酵母
【學(xué)位授予單位】：北京理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TS261.11
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 前言14-15
• 第1章 緒論15-35
• 1.1 β-香樹脂醇概述15-20
• 1.1.1 β-香樹脂醇的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)15
• 1.1.2 β-香樹脂醇的生物活性與用途15-16
• 1.1.3 β-香樹脂醇的來源16-18
• 1.1.4 β-香樹脂醇的生物合成途徑及在三萜合成中的地位18-20
• 1.2 工程化微生物細胞合成萜類化合物20-26
• 1.2.1 工程化大腸桿菌合成萜類化合物20-22
• 1.2.2 工程化釀酒酵母合成萜類化合物22-25
• 1.2.3 釀酒酵母合成 β-香樹脂醇的研究現(xiàn)狀25-26
• 1.3 釀酒酵母中人工途徑的組裝與調(diào)控26-34
• 1.3.1 DNA與途徑組裝技術(shù)26-29
• 1.3.2 酶表達水平的調(diào)控29-31
• 1.3.3 代謝途徑酶的空間定位31
• 1.3.4 基于Cre/LoxP系統(tǒng)的基因敲除31-32
• 1.3.5 ZENs和TALENs基因組編輯技術(shù)32-33
• 1.3.6 CRISPR/ Cas介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)33-34
• 1.4 本課題研究的內(nèi)容和意義34-35
• 第2章 β-香樹脂醇合成途徑在釀酒酵母中的構(gòu)建35-55
• 引言35
• 2.1 材料35-39
• 2.1.1 菌種與質(zhì)粒35-37
• 2.1.2 藥品及試劑37-38
• 2.1.3 儀器38-39
• 2.1.4 培養(yǎng)基39
• 2.2 方法39-49
• 2.2.1 釀酒酵母的培養(yǎng)39-40
• 2.2.2 酵母基因組的提取40
• 2.2.3 目標(biāo)片段的擴增與基因表達盒構(gòu)建40-42
• 2.2.4 質(zhì)粒的線性化42
• 2.2.5 DNA與質(zhì)粒的組裝42-43
• 2.2.6 酵母總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄43-44
• 2.2.7 基因表達水平檢測44-46
• 2.2.8 菌體生物量的測定46-47
• 2.2.9 β-香樹脂醇及其它代謝物的提取與測定47-49
• 2.3 結(jié)果與討論49-53
• 2.3.1 β-香樹脂醇合成途徑在釀酒酵母中的構(gòu)建49-50
• 2.3.2 β-香樹脂醇合酶在釀酒酵母中的轉(zhuǎn)錄情況50-51
• 2.3.3 釀酒酵母工程菌SpKb發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定51-52
• 2.3.4 不同表達載體對 β-香樹脂醇合成的影響52-53
• 2.4 小結(jié)53-55
• 第3章 平衡前體物鯊烯代謝提高 β-香樹脂醇合成55-78
• 引言55-56
• 3.1 材料56-58
• 3.1.1 菌種與質(zhì)粒56-57
• 3.1.2 藥品及試劑57
• 3.1.3 儀器57
• 3.1.4 培養(yǎng)基57-58
• 3.2 方法58-68
• 3.2.1 酵母基因組的提取58
• 3.2.2 大腸桿菌的基因組提取58
• 3.2.3 途徑的構(gòu)建與組裝方法58-59
• 3.2.4 過表達鯊烯單加氧酶工程菌株的構(gòu)建59-62
• 3.2.5 強化鯊烯合成工程菌的構(gòu)建62-64
• 3.2.6 SRE在啟動子中的重構(gòu)與工程菌構(gòu)建方法64-66
• 3.2.7 基因表達分析66
• 3.2.8 綠色熒光蛋白熒光強度檢測方法66-67
• 3.2.9 其他分析方法67-68
• 3.3 結(jié)果與討論68-77
• 3.3.1 外源鯊烯單加氧酶的表達與效果68-70
• 3.3.2 強化鯊烯供應(yīng)提高 β-香樹脂醇合成70-72
• 3.3.3 利用UPC2結(jié)合位點重構(gòu)啟動子增強途徑表達效率72-74
• 3.3.4 過表達UPC2-1 對 β-香樹脂醇合成的影響74-77
• 3.4 小結(jié)77-78
• 第4章 CRISPR/d Cas9修飾酵母內(nèi)源途徑優(yōu)化 β-香樹脂醇合成78-100
• 引言78-79
• 4.1 材料79-80
• 4.1.1 菌種與質(zhì)粒79
• 4.1.2 藥品及試劑79-80
• 4.1.3 儀器80
• 4.1.4 培養(yǎng)基80
• 4.2 方法80-90
• 4.2.1 目標(biāo)片段的擴增與基因表達盒構(gòu)建80-81
• 4.2.2 途徑的構(gòu)建與組裝方法81
• 4.2.3 表達dCas9蛋白工程菌的構(gòu)建81-82
• 4.2.4 CRISPR/dCas9驗證系統(tǒng)的構(gòu)建82-84
• 4.2.5 乙酰輔酶A合成強化工程菌的構(gòu)建方法84-86
• 4.2.6 目標(biāo)基因gRNA的設(shè)計與工程菌構(gòu)建86-89
• 4.2.7 基因表達分析89
• 4.2.8 β-半乳糖苷酶活性的測定89-90
• 4.2.9 其他分析方法90
• 4.3 結(jié)果與討論90-99
• 4.3.1 釀酒酵母中CRISPR/dCas9的設(shè)計90-91
• 4.3.2 dCas9蛋白表達模塊的構(gòu)建91-92
• 4.3.3 CRISPR/dCas9在釀酒酵母中的功能驗證92-94
• 4.3.4 CRISPR/dCas9下調(diào)羊毛甾醇合酶94-96
• 4.3.5 強化胞質(zhì)乙酰輔酶A合成96-97
• 4.3.6 CRISPR/dCas9一步多基因修飾 β-香樹脂醇合成途徑97-99
• 4.4 小結(jié)99-100
• 第5章 產(chǎn) β-香樹脂醇釀酒酵母的發(fā)酵工藝優(yōu)化100-108
• 引言100
• 5.1 材料100-101
• 5.1.1 菌種100
• 5.1.2 藥品及試劑100
• 5.1.3 儀器100-101
• 5.1.4 培養(yǎng)基101
• 5.2 方法101-102
• 5.2.1 種子液的制備101
• 5.2.2 2.5L發(fā)酵罐培養(yǎng)101
• 5.2.3 葡萄糖和乙醇濃度的測定101-102
• 5.2.4 其他分析方法102
• 5.3 結(jié)果與討論102-107
• 5.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)條件的優(yōu)化102-104
• 5.3.2 葡萄糖補料發(fā)酵104-105
• 5.3.3 乙醇補料發(fā)酵105-106
• 5.3.4 甲基-β-環(huán)糊精對 β-香樹脂醇合成的影響106-107
• 5.4 小結(jié)107-108
• 第6章 結(jié)論與展望108-110
• 6.1 結(jié)論108-109
• 6.2 創(chuàng)新點109
• 6.3 對今后工作的建議與展望109-110
• 參考文獻110-124
• 攻讀學(xué)位期間主要研究成果124-125
• 致謝125-126
• 作者簡介126

【共引文獻】

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本文編號：759959