發(fā)布時間：2017-08-29 08:26

  本文關(guān)鍵詞：家蠶體相關(guān)蛋白乙酰化修飾鑒定及其對蠶絲蛋白合成影響的研究

  更多相關(guān)文章： 家蠶 乙�；揎� 調(diào)控 蠶絲蛋白合成 絲膠蛋白 營養(yǎng)儲藏蛋白 SP蛋白

【摘要】：我們的祖先通過人工馴養(yǎng)和選擇將野蠶馴化為家蠶,將家蠶的產(chǎn)絲性能提高了約10倍。上世紀(jì)30年代,利用一代雜種優(yōu)勢又將蠶絲產(chǎn)量提高了近20%。至此以后,家蠶的產(chǎn)絲性能達(dá)到了頂峰,再也難以逾越,到目前為止還沒有革命性的突破�，F(xiàn)今,要取得新的突破必須從分子水平尋找家蠶絲蛋白合成的相關(guān)因素,并獲得絲蛋白調(diào)控的理論基礎(chǔ),因此,絲蛋白合成的調(diào)控機(jī)制研究越來越受到人們的關(guān)注。本課題首次從蛋白翻譯后修飾角度研究了乙�；揎棇倚Q絲蛋白合成的調(diào)控及其對蠶絲性能的影響,可為家蠶產(chǎn)絲性能的突破和蠶絲品質(zhì)的改良提供新的理論依據(jù)。由于乙�；揎椏梢愿淖兊鞍踪|(zhì)功能,因此我們首先使用乙酰化多肽富集與nano-HPLC/MS/MS結(jié)合,大規(guī)模鑒定了家蠶的乙�；M,首次從家蠶體中鑒定了342個乙酰化蛋白,包含667個賴氨酸乙�；揎�(Lysine acetylation,Kac)位點,乙酰化修飾的平均程度為1.9。含有5個以上Kac位點的乙酰化蛋白有20個,含有11個以上Kac位點的高度乙�；鞍子�7個,大部分為營養(yǎng)儲藏蛋白和絲膠蛋白,如儲藏蛋白SP、卵黃蛋白(vitellogenin)和家蠶載脂蛋白(apolipophorin)以及絲膠蛋白2(sericin2,Ser2)。Kac位置偏好性分析發(fā)現(xiàn)存在5個顯著富集的Kac位點基序,分別為KH、KY、KF、K*F和F*K,占整個Kac位點的55.7%,且傾向位于蛋白的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)中。功能分析表明,乙�；鞍字饕獏⑴c家蠶體內(nèi)的物質(zhì)與能量代謝,同時調(diào)控氨基酸的生物合成和存儲。總之,家蠶體內(nèi)的物質(zhì)和能量代謝受到乙�；揎椀膰�(yán)格調(diào)控,尤其是蛋白和氨基酸的生物合成和代謝。幼蟲階段是家蠶唯一攝食階段,本階段家蠶務(wù)必儲藏足夠的營養(yǎng)以備蠶絲蛋白合成和后續(xù)發(fā)育的營養(yǎng)需要。上述研究表明,儲藏脂肪的載脂蛋白、30K蛋白和卵黃蛋白以及儲藏氨基酸的儲藏蛋白SP(含SP1、SP3和SP3)等4類營養(yǎng)儲藏蛋白存在大量的Kac位點。暗示乙�；{(diào)控可能為家蠶營養(yǎng)儲藏、轉(zhuǎn)運和代謝的常規(guī)調(diào)控。發(fā)育期的蛋白表達(dá)譜和乙酰化譜進(jìn)一步證實,SP的蛋白水平和乙�；皆诩倚Q5齡幼蟲前中期豐度較高,在后期和吐絲期含量較低。由于SP蛋白主要負(fù)責(zé)儲藏氨基酸,因此5齡幼蟲前中期表達(dá)的大量SP蛋白及其儲藏的氨基酸可能為后期大量絲蛋白的合成提供氨基酸來源。同時研究表明,發(fā)育期sp蛋白的乙酰化水平隨蛋白水平的變化而變化,進(jìn)一步實驗證實,乙�；较抡{(diào)的家蠶細(xì)胞中sp蛋白的含量急劇減少,因此,我們推測乙酰化修飾和sp蛋白儲藏氨基酸的水解釋放和利用控制有關(guān),乙�；揎椏赏ㄟ^調(diào)控氨基酸的供給間接調(diào)控蠶絲蛋白的合成。結(jié)合其他營養(yǎng)儲藏蛋白在家蠶幼蟲發(fā)育期的乙�；V,我們證實家蠶營養(yǎng)儲藏類蛋白的高度乙酰化可能暗示了一種新的調(diào)控家蠶營養(yǎng)貯藏和水解利用的新機(jī)制,這個機(jī)制和絲蛋白的合成相關(guān)。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究表明,sp蛋白的賴氨酸乙酰化修飾可與泛素化修飾競爭,導(dǎo)致蛋白泛素化水平下調(diào),最終抑制泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑,提高sp蛋白穩(wěn)定性和含量。因此,乙�；揎椏赏ㄟ^競爭泛素化位點調(diào)控營養(yǎng)儲藏蛋白的穩(wěn)定和水解,從而調(diào)控其所儲藏營養(yǎng)物質(zhì)的儲存與釋放利用,最終影響和調(diào)控蠶絲蛋白的合成。綜上所述,家蠶5齡幼蟲前中期sp蛋白的乙�；揎椏赏ㄟ^競爭泛素化修飾導(dǎo)致蛋白大量積累,儲藏大量多余的氨基酸;幼蟲后期sp蛋白去乙酰化,導(dǎo)致蛋白劇烈降解并釋放其所儲藏的大量氨基酸以供絲蛋白的合成。乙酰化修飾參與了蠶絲蛋白的合成調(diào)控,是絲蛋白合成調(diào)控的新機(jī)制。蠶絲表層覆蓋有絲膠蛋白,包括ser1、ser2和ser3。我們首次通過質(zhì)譜鑒定ser2蛋白存在20多個kac位點;發(fā)育期乙酰化譜檢測進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ser1和ser3同樣存在高度乙�；揎�。根據(jù)淀粉乙酰化后的類固態(tài)形態(tài)的變化,我們推測絲膠蛋白的高度乙�；兄谠鰪�(qiáng)絲膠蛋白在蠶絲絲素纖維表層的附著力,這可能和絲膠蛋白乙酰基上的羰基氧原子與絲素纖維表層大量分布的酪氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和絲氨酸等氨基酸側(cè)鏈的親水基團(tuán)形成氫鍵等弱相互作用有關(guān)。根據(jù)甲殼素在堿水熱處理下可去乙�；牟蝗艿娇扇艿男再|(zhì)轉(zhuǎn)變,我們推測皂堿法熱處理的蠶絲精練脫膠過程實際上是一個絲膠蛋白去乙酰化增加溶解度或破壞絲膠蛋白與絲素表層氫鍵的過程,這為蠶絲精練脫膠工藝的改進(jìn)提供了新的理論依據(jù)。最后我們研究了乙酰化對家蠶細(xì)胞和蠶絲合成的影響。首先采用去乙�；敢种苿﹖sa和乙酰化酶抑制劑c646分別上調(diào)和下調(diào)細(xì)胞乙�；�,證實乙酰化水平的上升可以增強(qiáng)細(xì)胞的抗凋亡能力。進(jìn)一步采用注射tsa或c646的方法處理家蠶5齡幼蟲,收集制備乙酰化修飾蠶絲,力學(xué)測試表明,乙�；较陆悼蓪�(dǎo)致蠶絲斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率都有一定的下降,而乙酰化水平上升導(dǎo)致蠶絲的斷裂伸長率有一定的上升,但總體來說,乙�；瘜πQ絲的力學(xué)性能影響較小;紅外光譜分析顯示乙酰化對蠶絲纖維的結(jié)構(gòu)影響也不大;XRD表征分析表明,乙�；揎椥Q絲和對照蠶絲相比其結(jié)晶區(qū)較為穩(wěn)定,結(jié)晶結(jié)構(gòu)基本沒有發(fā)生變化,說明絲膠蛋白的乙酰化僅僅只能改變絲膠的性質(zhì),不會對蠶絲絲素纖維的結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響;掃描電子顯微鏡(SEM)觀察顯示,同樣脫膠條件下,乙�；揎椊M蠶絲的絲素表層附著一定的絲膠殘留,而乙酰化下降和對照組蠶絲的絲素表層較為干凈,進(jìn)一步證實了絲膠蛋白的乙�；哂性鰪�(qiáng)絲膠與絲素表層附著力的作用。綜上所述,本課題首次發(fā)現(xiàn)乙�；揎椏梢酝ㄟ^調(diào)控氨基酸的供應(yīng)影響蠶絲蛋白的合成;首次發(fā)現(xiàn)絲膠蛋白存在高度的乙酰化修飾,證實乙�；揎椏梢栽鰪�(qiáng)絲膠蛋白在絲素纖維表層的附著力。上述發(fā)現(xiàn)是蠶絲蛋白合成調(diào)控的新機(jī)制,可為家蠶產(chǎn)絲性能的提高以及蠶絲精練脫膠和染整工藝的改進(jìn)提供新的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：家蠶 乙酰化修飾 調(diào)控 蠶絲蛋白合成 絲膠蛋白 營養(yǎng)儲藏蛋白 SP蛋白
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TS141
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-14
• 第一章 前言14-29
• 1.1 課題背景與意義14-15
• 1.2 蛋白質(zhì)的乙�；揎椉捌涔δ�15-21
• 1.2.1 蛋白質(zhì)的乙酰化修飾15-16
• 1.2.2 組蛋白乙�；概c去乙酰化酶16-18
• 1.2.3 非組蛋白的乙酰化修飾18-21
• 1.2.3.1 非組蛋白乙�；c蛋白結(jié)構(gòu)的關(guān)系18-19
• 1.2.3.2 非組蛋白的乙酰化通過與泛素化修飾競爭提高蛋白穩(wěn)定性19-21
• 1.3 家蠶蠶絲蛋白21-25
• 1.3.1 絲素蛋白組成及結(jié)構(gòu)21-22
• 1.3.2 絲膠蛋白結(jié)構(gòu)及特性22-25
• 1.3.2.1 家蠶絲膠蛋白22
• 1.3.2.2 非家蠶蠶絲絲膠蛋白22-23
• 1.3.2.3 家蠶絲膠基因的結(jié)構(gòu)與表達(dá)特性23-24
• 1.3.2.4 絲膠蛋白的物理特性24-25
• 1.4 家蠶營養(yǎng)儲藏蛋白及其功能25-26
• 1.5 論文研究目的和主要研究內(nèi)容26-29
• 1.5.1 研究目的26
• 1.5.2 主要研究內(nèi)容26-28
• 1.5.3 課題創(chuàng)新點28-29
• 第二章 家蠶蛋白乙�；揎椀母咄胯b定29-52
• 2.1 材料、試劑及儀器設(shè)備29-32
• 2.1.1 主要材料與儀器29
• 2.1.2 主要試劑29
• 2.1.3 主要試劑配制29-32
• 2.2 方法32-34
• 2.2.1 家蠶總蛋白的提取和乙�；腤estern blot檢測32
• 2.2.2 乙酰化肽段富集和高精度質(zhì)譜nano-HPLC-MS/MS分析32-33
• 2.2.3 乙�；鞍椎淖⑨尯蜕镄畔W(xué)功能分析33-34
• 2.2.3.1 蛋白注釋33-34
• 2.2.3.2 功能富集分析34
• 2.2.3.3 二級結(jié)構(gòu)分析34
• 2.2.3.4 乙酰化位點序列模式分析34
• 2.3 結(jié)果與討論34-50
• 2.3.1 家蠶總蛋白乙�；疻estern blot檢測34-36
• 2.3.2 高精度質(zhì)譜高通量鑒定家蠶蛋白乙酰化修飾36-37
• 2.3.3 家蠶蛋白乙�；稽c具有特定的模式和偏好性37-39
• 2.3.4 家蠶乙酰化蛋白的功能特征39-43
• 2.3.5 乙�；揎椏赡転榧倚Q營養(yǎng)儲藏、轉(zhuǎn)運和代謝調(diào)控的常見機(jī)制43-48
• 2.3.6 乙�；揎椏赡軈⑴c家蠶幼蟲期蠶絲的合成調(diào)控48-50
• 2.4 本章結(jié)論50-52
• 第三章 家蠶各發(fā)育期營養(yǎng)儲藏蛋白和絲蛋白乙酰化的鑒定及其功能分析52-65
• 3.1 材料、試劑及儀器設(shè)備52-55
• 3.1.1 主要材料與儀器52
• 3.1.2 主要試劑52
• 3.1.3 主要試劑配制52-55
• 3.2 方法55-57
• 3.2.1 家蠶的飼養(yǎng)55
• 3.2.2 家蠶各發(fā)育期營養(yǎng)儲藏蛋白乙�；蔫b定55
• 3.2.3 家蠶各發(fā)育期絲蛋白乙酰化的鑒定55
• 3.2.4 SDS-PAGE鑒定55-56
• 3.2.5 Western blot鑒定56
• 3.2.6 PAGE膠點蛋白HPLC-MS/MS鑒定56-57
• 3.3 結(jié)果與討論57-63
• 3.3.1 家蠶各發(fā)育期營養(yǎng)儲藏蛋白乙�；那闆r57-59
• 3.3.2 家蠶各發(fā)育期蠶絲蛋白乙酰化的情況59-60
• 3.3.3 絲膠蛋白乙�；墓δ茴A(yù)測與分析60-63
• 3.4 本章結(jié)論63-65
• 第四章 乙酰化修飾提高SP2蛋白水平的機(jī)制研究及其調(diào)控蠶絲蛋白合成的過程分析65-75
• 4.1 材料、試劑及儀器設(shè)備65-66
• 4.1.1 主要材料與儀器65
• 4.1.2 主要試劑65
• 4.1.3 主要試劑配制65-66
• 4.2 方法66-68
• 4.2.1 家蠶BmN細(xì)胞貼壁培養(yǎng)66
• 4.2.2 TSA及C646對SP2蛋白含量的影響66-67
• 4.2.3 CHX抑制蛋白質(zhì)合成對TSA上調(diào)SP2含量的影響67
• 4.2.4 MG132抑制蛋白質(zhì)的泛素化降解途徑對TSA上調(diào)SP2含量的影響67
• 4.2.5 家蠶細(xì)胞中重組HIS-SP2蛋白的免疫共沉淀67-68
• 4.2.6 SP2蛋白賴氨酸乙酰化及泛素化修飾的競爭鑒定68
• 4.3 結(jié)果與討論68-73
• 4.3.1 乙酰化修飾對SP2蛋白表達(dá)含量的影響68-70
• 4.3.2 乙�；揎椡ㄟ^抑制蛋白酶體降解途徑來提高SP2蛋白含量70-71
• 4.3.3 乙酰化修飾通過競爭SP2蛋白的泛素化修飾來抑制泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑71-72
• 4.3.4 乙�；揎椪{(diào)控蠶絲蛋白合成的過程分析72-73
• 4.4 本章結(jié)論73-75
• 第五章 乙酰化修飾對家蠶細(xì)胞和蠶絲合成的影響研究75-88
• 5.1 材料、試劑及儀器設(shè)備75-77
• 5.1.1 主要材料與儀器75
• 5.1.2 主要試劑75-76
• 5.1.3 主要試劑配制76-77
• 5.2 方法77-80
• 5.2.1 SP2蛋白真核表達(dá)載體pIEx1BmSP2的構(gòu)建77-79
• 5.2.1.1 SP2基因的PCR擴(kuò)增77-78
• 5.2.1.2 PCR產(chǎn)物的酶切78
• 5.2.1.3 連接反應(yīng)78-79
• 5.2.1.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化79
• 5.2.1.5 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定79
• 5.2.1.6 重組質(zhì)粒的測序鑒定79
• 5.2.2 乙酰化對家蠶細(xì)胞生長的影響79-80
• 5.2.3 乙�；Q絲樣品的制備80
• 5.2.4 乙酰化蠶絲的性能測試80
• 5.3 結(jié)果與討論80-87
• 5.3.1 SP2真核表達(dá)載體的構(gòu)建80-81
• 5.3.2 乙�；瘜倚QBmN細(xì)胞抗凋亡的作用81-82
• 5.3.3 乙酰化蠶絲的力學(xué)性能82-84
• 5.3.4 乙�；Q絲的紅外光譜檢測84-85
• 5.3.5 乙酰化蠶絲的X射線衍射檢測85
• 5.3.6 乙�；Q絲的掃描電鏡表征85-87
• 5.4 本章結(jié)論87-88
• 第六章 結(jié)論與展望88-91
• 6.1 結(jié)論88-89
• 6.2 展望89-91
• 參考文獻(xiàn)91-99
• 致謝99-100
• 博士在讀期間發(fā)表論文100-101
• 附錄101-128

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本文編號：752294