發(fā)布時間：2017-06-15 14:04

  本文關鍵詞：細菌來源的α-葡糖苷酶HaG的三維立體結構解析及催化反應機理分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：α-葡糖苷酶是一種廣泛存在于生物體中、參與初級代謝反應的最重要的酶之一。它與多種疾病如糖尿病、癌癥等相關,并且在工業(yè)生產和醫(yī)藥領域都有廣泛的應用。本研究以來源于海洋嗜鹽菌的α-葡糖苷酶Ha G為研究對象,以單晶X射線衍射為主要研究手段,通過解析其三維立體結構,結合生化學實驗,從原子水平上闡明了其外在特殊性質的內在分子機制,建立了結構與功能之間的關系,為α-葡糖苷酶的改造和應用奠定基礎。主要研究內容與結果如下:一、野生型Ha G的異源表達、純化,晶體制備和結構解析將Ha G的基因克隆至表達載體p FLAG-CTS中,于大腸桿菌中進行過量表達。采用滲透休克法提取目的蛋白,并依次選用弱陰離子交換柱層析和分子排阻色譜等方法得到了高純度、有活性的Ha G蛋白質樣品。采用坐滴法進行蛋白質結晶,經過篩選和優(yōu)化,成功地獲得了可供衍射用的高質量蛋白質單晶。在日本同步輻射中心采集晶體衍射數(shù)據(jù),通過分子置換法解析了Ha G的三維立體結構。Ha G在立體結構上分為主要負責催化的N末端結構域、維持構型穩(wěn)定的C末端結構域以及一個亞結構域,其活性中心口袋由15個氨基酸殘基構成,位于N末端結構域的(α/β)8桶狀結構中間。二、Ha G及其突變體與配基復合體的晶體結構解析通過定點突變獲得了沒有催化活性的突變體E271Q、D202N和D333N,以共結晶或浸泡的方法篩選得到4種復合體晶體:(1)Glucosyl-Ha G,為野生型Ha G催化反應的中間體,體現(xiàn)了α-葡糖苷酶催化反應的真實過程;(2)E271Q-Mal,為GH13家族中首個α-(1,4)糖苷鍵類型的底物復合體結構,此結構中存在114個殘基電子云密度缺失,推測此部分在反應發(fā)生時會移動,使底物順利進入活性中心口袋;(3)D202N-Glu-Gly,模擬了以甘油為接受底物時的糖基轉移反應,闡明了Ha G催化甘油生成甘油葡萄糖苷的反應特點;(4)D333N-Rb,利用重金屬Rb+在特殊波長X射線下的異常信號確定了Rb+在晶體結構中的位置。三、Ha G底物特異性和催化反應機理的結構學基礎通過將Ha G復合體結構與其他酶對比分析,并結合突變實驗和酶學實驗,闡明了Ha G底物特異性:(1)Ha G特有的超長(β→α)4無規(guī)則卷曲阻擋于活性中心入口處,決定了其對于短鏈底物的特異性;(2)底物糖苷鍵特異性是由兩個殘基Thr203和Phe297所決定的,同時,殘基Gly228對糖苷鍵的識別也有輔助作用。并且,將所有的復合體結構聯(lián)系起來,闡明了反應機理的分子機制,為經典的雙替代理論提供了結構學基礎。
【關鍵詞】：α-葡糖苷酶 蛋白質結晶 三維立體結構 底物特異性 催化機理
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：O629.8
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第一章 緒論14-30
• 1.1 α-葡糖苷酶的研究現(xiàn)狀14-17
• 1.1.1 α-葡糖苷酶的定義與來源14
• 1.1.2 α-葡糖苷酶的分類14-15
• 1.1.3 α-葡糖苷酶的催化原理15-17
• 1.2 α-葡糖苷酶在生產中的重要應用17-18
• 1.2.1 工業(yè)生產低聚異麥芽糖17
• 1.2.2 嗜熱 α-葡糖苷酶在酒精生產中的應用17
• 1.2.3 催化合成糖基化產物17-18
• 1.2.4 α-葡糖苷酶抑制劑治療糖尿病18
• 1.3 α-葡糖苷酶HaG的研究背景18-21
• 1.4 研究生物大分子的最重要方法——蛋白質單晶X射線衍射21-26
• 1.4.1 結構生物學的研究方法21-23
• 1.4.2 單晶XRD解析蛋白質立體結構23-26
• 1.4.3 蛋白質結晶學的重要意義26
• 1.5 本論文的研究背景和研究內容26-30
• 1.5.1 研究背景26-29
• 1.5.2 主要研究內容29
• 1.5.3 研究意義29-30
• 第二章 α-葡糖苷酶 HaG 的體外表達及其分離純化30-47
• 2.1 引言30-31
• 2.2 實驗儀器及材料31-32
• 2.2.1 儀器設備31
• 2.2.2 主要實驗材料與試劑31-32
• 2.3 實驗方法32-38
• 2.3.1 HaG的異源表達載體的構建32-33
• 2.3.2 HaG重組蛋白的誘導表達與大量制備33-35
• 2.3.3 滲透休克法提取周質蛋白35-36
• 2.3.4 陰離子交換柱層析分離重組蛋白36-37
• 2.3.5 分子排阻色譜純化重組蛋白37-38
• 2.3.6 高純度重組蛋白的透析38
• 2.4 結果與討論38-46
• 2.4.1 HaG的蛋白質序列分析38-40
• 2.4.2 HaG重組蛋白誘導表達檢驗40-42
• 2.4.3 HaG重組蛋白的分離純化42-46
• 2.5 本章小結46-47
• 第三章 葡糖苷酶HaG的蛋白質單晶制備研究47-56
• 3.1 引言47
• 3.2 實驗儀器及材料47-48
• 3.2.1 儀器設備47-48
• 3.2.2 主要實驗材料與試劑48
• 3.3 實驗方法48-50
• 3.3.1 結晶前蛋白質樣品的準備48-49
• 3.3.2 HaG蛋白質結晶條件初篩49
• 3.3.3 In-house X射線衍射初步鑒定49-50
• 3.3.4 HaG蛋白質結晶條件的優(yōu)化與高質量晶體的制備50
• 3.4 結果與討論50-55
• 3.4.1 結晶初篩結果50-52
• 3.4.2 X射線衍射初步鑒定52-54
• 3.4.3 HaG蛋白質結晶條件的優(yōu)化結果與單晶鑒定54-55
• 3.5 本章小結55-56
• 第四章 野生型 HaG 晶體的衍射數(shù)據(jù)采集和結構解析56-75
• 4.1 引言56-57
• 4.2 實驗儀器及材料57-58
• 4.2.1 儀器設備57
• 4.2.2 主要實驗材料與試劑57-58
• 4.3 實驗方法58-63
• 4.3.1 蛋白晶體的凍結58-59
• 4.3.2 HaG蛋白晶體X射線衍射的數(shù)據(jù)采集59-60
• 4.3.3 HaG蛋白質晶體數(shù)據(jù)處理60-61
• 4.3.4 分子置換法確定HaG蛋白質結構的相位61-62
• 4.3.5 HaG蛋白質結構的優(yōu)化62
• 4.3.6 HaG蛋白質結構的分析與圖片繪制62-63
• 4.4 結果與討論63-74
• 4.4.1 HaG蛋白質晶體的數(shù)據(jù)采集63-64
• 4.4.2 HaG蛋白分子結構解析過程64-68
• 4.4.3 野生型HaG蛋白質的立體結構分析68-74
• 4.5 本章小結74-75
• 第五章 α-葡糖苷酶突變體建構、表達及其復合體晶體制備與結構解析75-96
• 5.1 引言75-76
• 5.2 實驗儀器及材料76-77
• 5.2.1 儀器設備76
• 5.2.2 主要實驗材料與試劑76-77
• 5.3 實驗方法77-81
• 5.3.1 活性缺失突變體的制備77-78
• 5.3.2 復合體晶體篩選與制備78-79
• 5.3.3 HaG及其突變體的復合體晶體的數(shù)據(jù)采集及處理79-80
• 5.3.4 HaG及其突變體的復合體結構解析80-81
• 5.3.5 圓二色譜測定突變體二級結構的無序程度81
• 5.4 結果與討論81-94
• 5.4.1 復合體晶體的制備81-82
• 5.4.2 復合體晶體的結構解析82-85
• 5.4.3 復合體立體結構分析85-94
• 5.5 本章小結94-96
• 第六章 HaG 的底物特異性和催化機理的分子機制96-112
• 6.1 引言96
• 6.2 實驗儀器及材料96-97
• 6.2.1 儀器設備96
• 6.2.2 主要實驗材料與試劑96-97
• 6.3 實驗方法97-100
• 6.3.1 HaG片段缺失突變體的制備97-98
• 6.3.2 HaG片段缺失突變體（HaG-LD）的酶活測定98-99
• 6.3.3 HaG復合體與其他糖苷水解酶的結構對比99-100
• 6.4 結果與討論100-110
• 6.4.1 HaG片段缺失突變體的制備過程100-102
• 6.4.2 HaG片段缺失突變體的酶學性質分析102-104
• 6.4.3 HaG底物特異性的結構學分析104-108
• 6.4.4 α-葡糖苷酶HaG催化反應機理分析108-110
• 6.5 本章小結110-112
• 結論與展望112-116
• 參考文獻116-126
• 攻讀博士學位期間取得的研究成果126-127
• 致謝127-128
• 附件128

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 黃祥斌,于淑娟;低聚異麥芽糖的最新研究進展[J];中國甜菜糖業(yè);2003年03期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉軍;嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）α-葡萄糖苷酶基因的克隆、表達及酶學性質分析[D];北京化工大學;2006年

  本文關鍵詞：細菌來源的α-葡糖苷酶HaG的三維立體結構解析及催化反應機理分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：452600