本文關(guān)鍵詞：細(xì)菌來(lái)源的α-葡糖苷酶HaG的三維立體結(jié)構(gòu)解析及催化反應(yīng)機(jī)理分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：α-葡糖苷酶是一種廣泛存在于生物體中、參與初級(jí)代謝反應(yīng)的最重要的酶之一。它與多種疾病如糖尿病、癌癥等相關(guān),并且在工業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)藥領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。本研究以來(lái)源于海洋嗜鹽菌的α-葡糖苷酶Ha G為研究對(duì)象,以單晶X射線衍射為主要研究手段,通過(guò)解析其三維立體結(jié)構(gòu),結(jié)合生化學(xué)實(shí)驗(yàn),從原子水平上闡明了其外在特殊性質(zhì)的內(nèi)在分子機(jī)制,建立了結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系,為α-葡糖苷酶的改造和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:一、野生型Ha G的異源表達(dá)、純化,晶體制備和結(jié)構(gòu)解析將Ha G的基因克隆至表達(dá)載體p FLAG-CTS中,于大腸桿菌中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)。采用滲透休克法提取目的蛋白,并依次選用弱陰離子交換柱層析和分子排阻色譜等方法得到了高純度、有活性的Ha G蛋白質(zhì)樣品。采用坐滴法進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶,經(jīng)過(guò)篩選和優(yōu)化,成功地獲得了可供衍射用的高質(zhì)量蛋白質(zhì)單晶。在日本同步輻射中心采集晶體衍射數(shù)據(jù),通過(guò)分子置換法解析了Ha G的三維立體結(jié)構(gòu)。Ha G在立體結(jié)構(gòu)上分為主要負(fù)責(zé)催化的N末端結(jié)構(gòu)域、維持構(gòu)型穩(wěn)定的C末端結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)亞結(jié)構(gòu)域,其活性中心口袋由15個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,位于N末端結(jié)構(gòu)域的(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)中間。二、Ha G及其突變體與配基復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)解析通過(guò)定點(diǎn)突變獲得了沒(méi)有催化活性的突變體E271Q、D202N和D333N,以共結(jié)晶或浸泡的方法篩選得到4種復(fù)合體晶體:(1)Glucosyl-Ha G,為野生型Ha G催化反應(yīng)的中間體,體現(xiàn)了α-葡糖苷酶催化反應(yīng)的真實(shí)過(guò)程;(2)E271Q-Mal,為GH13家族中首個(gè)α-(1,4)糖苷鍵類型的底物復(fù)合體結(jié)構(gòu),此結(jié)構(gòu)中存在114個(gè)殘基電子云密度缺失,推測(cè)此部分在反應(yīng)發(fā)生時(shí)會(huì)移動(dòng),使底物順利進(jìn)入活性中心口袋;(3)D202N-Glu-Gly,模擬了以甘油為接受底物時(shí)的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng),闡明了Ha G催化甘油生成甘油葡萄糖苷的反應(yīng)特點(diǎn);(4)D333N-Rb,利用重金屬Rb+在特殊波長(zhǎng)X射線下的異常信號(hào)確定了Rb+在晶體結(jié)構(gòu)中的位置。三、Ha G底物特異性和催化反應(yīng)機(jī)理的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)通過(guò)將Ha G復(fù)合體結(jié)構(gòu)與其他酶對(duì)比分析,并結(jié)合突變實(shí)驗(yàn)和酶學(xué)實(shí)驗(yàn),闡明了Ha G底物特異性:(1)Ha G特有的超長(zhǎng)(β→α)4無(wú)規(guī)則卷曲阻擋于活性中心入口處,決定了其對(duì)于短鏈底物的特異性;(2)底物糖苷鍵特異性是由兩個(gè)殘基Thr203和Phe297所決定的,同時(shí),殘基Gly228對(duì)糖苷鍵的識(shí)別也有輔助作用。并且,將所有的復(fù)合體結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來(lái),闡明了反應(yīng)機(jī)理的分子機(jī)制,為經(jīng)典的雙替代理論提供了結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：α-葡糖苷酶 蛋白質(zhì)結(jié)晶 三維立體結(jié)構(gòu) 底物特異性 催化機(jī)理
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：O629.8
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第一章 緒論14-30
• 1.1 α-葡糖苷酶的研究現(xiàn)狀14-17
• 1.1.1 α-葡糖苷酶的定義與來(lái)源14
• 1.1.2 α-葡糖苷酶的分類14-15
• 1.1.3 α-葡糖苷酶的催化原理15-17
• 1.2 α-葡糖苷酶在生產(chǎn)中的重要應(yīng)用17-18
• 1.2.1 工業(yè)生產(chǎn)低聚異麥芽糖17
• 1.2.2 嗜熱 α-葡糖苷酶在酒精生產(chǎn)中的應(yīng)用17
• 1.2.3 催化合成糖基化產(chǎn)物17-18
• 1.2.4 α-葡糖苷酶抑制劑治療糖尿病18
• 1.3 α-葡糖苷酶HaG的研究背景18-21
• 1.4 研究生物大分子的最重要方法——蛋白質(zhì)單晶X射線衍射21-26
• 1.4.1 結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究方法21-23
• 1.4.2 單晶XRD解析蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)23-26
• 1.4.3 蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)的重要意義26
• 1.5 本論文的研究背景和研究?jī)?nèi)容26-30
• 1.5.1 研究背景26-29
• 1.5.2 主要研究?jī)?nèi)容29
• 1.5.3 研究意義29-30
• 第二章 α-葡糖苷酶 HaG 的體外表達(dá)及其分離純化30-47
• 2.1 引言30-31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料31-32
• 2.2.1 儀器設(shè)備31
• 2.2.2 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑31-32
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法32-38
• 2.3.1 HaG的異源表達(dá)載體的構(gòu)建32-33
• 2.3.2 HaG重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與大量制備33-35
• 2.3.3 滲透休克法提取周質(zhì)蛋白35-36
• 2.3.4 陰離子交換柱層析分離重組蛋白36-37
• 2.3.5 分子排阻色譜純化重組蛋白37-38
• 2.3.6 高純度重組蛋白的透析38
• 2.4 結(jié)果與討論38-46
• 2.4.1 HaG的蛋白質(zhì)序列分析38-40
• 2.4.2 HaG重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)檢驗(yàn)40-42
• 2.4.3 HaG重組蛋白的分離純化42-46
• 2.5 本章小結(jié)46-47
• 第三章 葡糖苷酶HaG的蛋白質(zhì)單晶制備研究47-56
• 3.1 引言47
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料47-48
• 3.2.1 儀器設(shè)備47-48
• 3.2.2 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑48
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法48-50
• 3.3.1 結(jié)晶前蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)備48-49
• 3.3.2 HaG蛋白質(zhì)結(jié)晶條件初篩49
• 3.3.3 In-house X射線衍射初步鑒定49-50
• 3.3.4 HaG蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的優(yōu)化與高質(zhì)量晶體的制備50
• 3.4 結(jié)果與討論50-55
• 3.4.1 結(jié)晶初篩結(jié)果50-52
• 3.4.2 X射線衍射初步鑒定52-54
• 3.4.3 HaG蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的優(yōu)化結(jié)果與單晶鑒定54-55
• 3.5 本章小結(jié)55-56
• 第四章 野生型 HaG 晶體的衍射數(shù)據(jù)采集和結(jié)構(gòu)解析56-75
• 4.1 引言56-57
• 4.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料57-58
• 4.2.1 儀器設(shè)備57
• 4.2.2 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑57-58
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法58-63
• 4.3.1 蛋白晶體的凍結(jié)58-59
• 4.3.2 HaG蛋白晶體X射線衍射的數(shù)據(jù)采集59-60
• 4.3.3 HaG蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)處理60-61
• 4.3.4 分子置換法確定HaG蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的相位61-62
• 4.3.5 HaG蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化62
• 4.3.6 HaG蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析與圖片繪制62-63
• 4.4 結(jié)果與討論63-74
• 4.4.1 HaG蛋白質(zhì)晶體的數(shù)據(jù)采集63-64
• 4.4.2 HaG蛋白分子結(jié)構(gòu)解析過(guò)程64-68
• 4.4.3 野生型HaG蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)分析68-74
• 4.5 本章小結(jié)74-75
• 第五章 α-葡糖苷酶突變體建構(gòu)、表達(dá)及其復(fù)合體晶體制備與結(jié)構(gòu)解析75-96
• 5.1 引言75-76
• 5.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料76-77
• 5.2.1 儀器設(shè)備76
• 5.2.2 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑76-77
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法77-81
• 5.3.1 活性缺失突變體的制備77-78
• 5.3.2 復(fù)合體晶體篩選與制備78-79
• 5.3.3 HaG及其突變體的復(fù)合體晶體的數(shù)據(jù)采集及處理79-80
• 5.3.4 HaG及其突變體的復(fù)合體結(jié)構(gòu)解析80-81
• 5.3.5 圓二色譜測(cè)定突變體二級(jí)結(jié)構(gòu)的無(wú)序程度81
• 5.4 結(jié)果與討論81-94
• 5.4.1 復(fù)合體晶體的制備81-82
• 5.4.2 復(fù)合體晶體的結(jié)構(gòu)解析82-85
• 5.4.3 復(fù)合體立體結(jié)構(gòu)分析85-94
• 5.5 本章小結(jié)94-96
• 第六章 HaG 的底物特異性和催化機(jī)理的分子機(jī)制96-112
• 6.1 引言96
• 6.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料96-97
• 6.2.1 儀器設(shè)備96
• 6.2.2 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑96-97
• 6.3 實(shí)驗(yàn)方法97-100
• 6.3.1 HaG片段缺失突變體的制備97-98
• 6.3.2 HaG片段缺失突變體（HaG-LD）的酶活測(cè)定98-99
• 6.3.3 HaG復(fù)合體與其他糖苷水解酶的結(jié)構(gòu)對(duì)比99-100
• 6.4 結(jié)果與討論100-110
• 6.4.1 HaG片段缺失突變體的制備過(guò)程100-102
• 6.4.2 HaG片段缺失突變體的酶學(xué)性質(zhì)分析102-104
• 6.4.3 HaG底物特異性的結(jié)構(gòu)學(xué)分析104-108
• 6.4.4 α-葡糖苷酶HaG催化反應(yīng)機(jī)理分析108-110
• 6.5 本章小結(jié)110-112
• 結(jié)論與展望112-116
• 參考文獻(xiàn)116-126
• 攻讀博士學(xué)位期間取得的研究成果126-127
• 致謝127-128
• 附件128

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 黃祥斌,于淑娟;低聚異麥芽糖的最新研究進(jìn)展[J];中國(guó)甜菜糖業(yè);2003年03期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉軍;嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）α-葡萄糖苷酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析[D];北京化工大學(xué);2006年

  本文關(guān)鍵詞：細(xì)菌來(lái)源的α-葡糖苷酶HaG的三維立體結(jié)構(gòu)解析及催化反應(yīng)機(jī)理分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：452600