本文關(guān)鍵詞：甲基丙烯酸酯類高性能基因載體的構(gòu)建、制備與表征，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著人類社會的發(fā)展,遺傳性疾病、癌癥以及心血管疾病等重大疾病的發(fā)病率逐年上升,嚴重威脅人類的健康,傳統(tǒng)的醫(yī)療手段很難徹底治愈這些疾病,基因治療利用將外源正常基因?qū)氚屑毎姆绞綖檫@些疾病開辟了新的治療手段。目前,制約基因治療的關(guān)鍵是缺乏既安全又高效的基因載體,由于病毒載體的安全性較差,人們的研究重心轉(zhuǎn)向了非病毒基因載體的研制,而目前研究最廣泛的非病毒基因載體是陽離子聚合物。原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)是一種活性可控的聚合方法,其反應(yīng)溫度適中、適用單體種類多,非常適用于制備多功能的陽離子聚合物。本論文根據(jù)目前非病毒基因載體材料的發(fā)展趨勢,針對載體轉(zhuǎn)染效率低且毒性高的科學(xué)問題,在ATRP法的基礎(chǔ)上制備了一系列高性能的甲基丙烯酸酯類陽離子基因載體,通過細胞實驗和動物實驗評價了載體的基因轉(zhuǎn)染效率,對促進安全高效的非病毒基因載體的研制具有重要意義。乙醇胺(EA)功能化的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)衍生物基因載體(PGEA)由于含有豐富的仲胺和羥基基團,在不同的細胞系中,具有較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的細胞毒性。我們利用低分子量的PGEA對花-3,4,9,10-四羧酸二酰亞胺(PBI)進行修飾,制備出一種帶有熒光成像功能的雙功能陽離子基因載體(PBI-PGEA)。這種載體材料在不同的細胞系中均能表現(xiàn)出較高的基因轉(zhuǎn)染效率。此外,PBI-PGEA能夠在2-5分鐘內(nèi)快速有效地完成對細胞的染色,并且在染色過程中不會產(chǎn)生明顯的細胞毒性,避免了對細胞可能產(chǎn)生的副反應(yīng)。根據(jù)相關(guān)報道,生物還原性的引入會提高基因載體的轉(zhuǎn)染效率。本論文中,我們利用天然多糖Pullulan的肝細胞特異性以及具有生物還原性的雙硫鍵,通過ATRP法成功地制備了具有良好生物相容性的可剪切的肝靶向性梳狀陽離子基因載體,首先在普魯蘭的羥基上引入含有可生物還原雙硫鍵的ATRP引發(fā)位點,隨后通過ATRP反應(yīng)引入PGMA側(cè)鏈,最后通過醇胺(EA)功能化合成以普魯蘭多糖為骨架,可生物還原的肝靶向性梳狀陽離子基因載體PuPGEA。該載體材料不僅具有優(yōu)于陽離子基因載體的國際金標PEI的基因轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性,而且通過在不同細胞內(nèi)吞抑制劑存在的情況下進行基因轉(zhuǎn)染測試,發(fā)現(xiàn)PuPGEA系列載體材料具有肝細胞靶向性,通過溶血性測試,發(fā)現(xiàn)PuPGEA系列載體材料具有極好的血液相容性。在制備了具有較高轉(zhuǎn)染效率和較低細胞毒性載體的基礎(chǔ)上,我們又制備出了一種既能夠傳遞基因又能夠運送抗癌藥物的雙功能基因載體。首先利用簡單的兩步法在氧化石墨烯表面引入含有雙硫鍵的ATRP引發(fā)位點,隨后在其表面可控地引發(fā)甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)聚合,制備一系列有機-無機雜化產(chǎn)物(SS-GPD),通過X射線光電子能譜(XPS)和原子力顯微鏡(AFM)表征氧化石墨烯以及SS-GPD納米顆粒。與純的氧化石墨烯片層和PDMAEMA均聚物相比,SS-GPD系列載體材料表現(xiàn)出更好的DNA縮合能力,更低的細胞毒性以及更高的轉(zhuǎn)染效率。此外,氧化石墨烯片層可與帶芳香環(huán)的抗癌藥物10-羥基喜樹堿(CPT)形成共軛結(jié)構(gòu),通過對細胞進行活性測試,發(fā)現(xiàn)SS-GPD系列材料可以很好地將藥物運送到細胞內(nèi),因此其可被作為潛在的藥物載體。心血管疾病是一直以來都是人類健康的頭號殺手,居各種死亡原因首位,盡管有如他汀類藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑以及B-受體阻滯藥等治療性藥物,心血管疾病的發(fā)病率一直持續(xù)增長,因此需要開發(fā)新型的治療手段。最近,有研究結(jié)果表明miR-29b的過表達可以減輕慢性腎臟疾病的纖維化、肺臟纖維化及心臟纖維化。我們之前的研究表明,EA功能化的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGEA)具有大量的仲胺基團,使其具有良好的基因傳遞效率,同時,由于其側(cè)鏈上含有大量的羥基,使得材料的毒性較低,并且,特殊形狀(如星型或梳狀)陽離子聚合物與同等分子量的線性聚合物相比,具有更低的細胞毒性和更高的轉(zhuǎn)染效率,在此基礎(chǔ)之上,我們利用BIBB修飾的季戊四醇(PER)作為引發(fā)劑,與GMA進行ATRP聚合,合成星狀聚合物star-like PGMA (s-PGMA),并通過后續(xù)的EA功能化,合成以PER為核心的星型陽離子聚合物基因載體s-PGEA,該載體在小鼠心臟成纖維細胞中具有較高的轉(zhuǎn)染效率,并且,s-PGEA還可以與帶有下調(diào)相關(guān)靶基因功能的miR-29b絡(luò)合,形成均勻的納米級復(fù)合體,通過靜脈注射,使藥物有效富集到小鼠的心臟部位,通過基因傳遞,使得miRNA發(fā)揮相應(yīng)的下調(diào)功能,能有效減輕小鼠的心臟纖維化。此外,合成的載體材料與PEI相比,具有良好的生物相容性和抗蛋白吸附性,能延長其在體內(nèi)的循環(huán)時間,進而提高載體在體內(nèi)的效果。綜上所述,通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的方法在不同的功能性材料上接枝甲基丙烯酸酯類聚合物,對構(gòu)建新型多功能陽離子基因載體具有重要意
【關(guān)鍵詞】：基因治療 陽離子基因載體 甲基丙烯酸酯 ATRP PDMAEMA 氧化石墨稀 PGMA 普魯蘭多糖
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R450;O631
【目錄】：

• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集4-5
• 摘要5-9
• ABSTRACT9-25
• 符號說明25-26
• 第一章 緒論26-42
• 1.1 基因治療26-28
• 1.2 基因傳遞系統(tǒng)28-32
• 1.2.1 用于傳遞基因的病毒載體29
• 1.2.2 非病毒基因傳遞系統(tǒng)29-30
• 1.2.3 化學(xué)法制備的非病毒基因載體30-32
• 1.2.3.1 通過電荷吸引絡(luò)合DNA的聚陽離子載體30-32
• 1.2.3.2 DNA封裝技術(shù)32
• 1.2.3.3 DNA吸收32
• 1.3 原子轉(zhuǎn)移自由基聚合在生物醫(yī)用材料方面的應(yīng)用32-40
• 1.3.1 ATRP法制備生物活性表面33-35
• 1.3.2 ATRP法應(yīng)用于制備陽離子聚合物基因載體35-40
• 1.3.2.1 線型均聚物基因載體36-37
• 1.3.2.2 線型嵌段共聚物基因載體37-38
• 1.3.2.3 梳狀共聚物基因載體38-39
• 1.3.2.4 星狀聚合物基因載體39-40
• 1.4 課題的目的及意義40-42
• 第二章 可快速進行細胞染色的雙功能基因載體42-58
• 2.1 前言42
• 2.2 實驗部分42-47
• 2.2.1 實驗原料與試劑42-44
• 2.2.2 實驗儀器與設(shè)備44
• 2.2.3 實驗方法44
• 2.2.4 雙功能陽離子基因載體PBI-PGEA的制備44-45
• 2.2.5 聚合物的化學(xué)及光譜學(xué)測試45
• 2.2.6 載體的細胞標記性能測試45-46
• 2.2.7 載體的轉(zhuǎn)染能力測試46-47
• 2.2.7.1 PBI-PGE-pDNA復(fù)合體的瓊脂糖凝膠電泳測試46
• 2.2.7.2 PBI-PGEA/pDNA復(fù)合體的粒徑及電位測試46-47
• 2.2.7.3 PBI-PGEA/pDNA復(fù)合體的轉(zhuǎn)染能力測試47
• 2.3 結(jié)果與討論47-57
• 2.3.1 雙功能陽離子基因載體PBI-PGEA的制備47-49
• 2.3.2 PBI-PGEA的光譜性質(zhì)49-50
• 2.3.3 PBI-PGEA的細胞標記性能測試50-54
• 2.3.4 PBI-PGEA的轉(zhuǎn)染能力測試54-57
• 2.4 小結(jié)57-58
• 第三章 基于普魯蘭多糖構(gòu)建可生物剪切的肝靶向性基因載體58-80
• 3.1 前言58
• 3.2 實驗部分58-64
• 3.2.1 實驗原料與試劑59-60
• 3.2.2 實驗儀器與設(shè)備60
• 3.2.3 實驗方法60
• 3.2.4 可生物剪切的肝靶向性陽離子基因載體PuPGEA的制備60-61
• 3.2.4.1 可生物剪切的ATRP引發(fā)位點的引入60-61
• 3.2.4.2 通過ATRP法合成普魯蘭基陽離子基因載體61
• 3.2.5 陽離子基因載體PuPGEA的化學(xué)表征61-62
• 3.2.6 聚合物/pDNA復(fù)合體的生理物理學(xué)測試62
• 3.2.6.1 瓊脂糖凝膠電泳測試62
• 3.2.6.2 粒徑及Zeta電位測試62
• 3.2.6.3 PuPGEA/pDNA顆粒形態(tài)測試62
• 3.2.7 載體的轉(zhuǎn)染能力及細胞毒性測試62-63
• 3.2.7.1 細胞毒性測試63
• 3.2.7.2 體外轉(zhuǎn)染效率測試63
• 3.2.8 載體的肝靶向性測試63-64
• 3.2.9 載體的溶血性測試64
• 3.3 結(jié)果與討論64-79
• 3.3.1 可生物剪切的肝靶向性陽離子基因載體PuPGEA的制備及化學(xué)表征64-68
• 3.3.1.1 陽離子基因載體PuPGEA的制備及核磁表征64-67
• 3.3.1.2 陽離子基因載體PuPGEA的分子量表征67-68
• 3.3.1.3 陽離子基因載體PuPGEA的生物可剪切性測試68
• 3.3.2 載體與DNA復(fù)合體的生理物理學(xué)表征68-71
• 3.3.3 載體的細胞毒性及轉(zhuǎn)染能力表征71-75
• 3.3.3.1 載體的細胞毒性測試71-73
• 3.3.3.2 載體的體外基因轉(zhuǎn)染效率73-75
• 3.3.4 載體的肝靶向性測試75-77
• 3.3.5 載體的溶血性測試77-79
• 3.4 小結(jié)79-80
• 第四章 基于氧化石墨烯構(gòu)建可生物剪切的基因/藥物載體80-102
• 4.1 前言80
• 4.2 實驗部分80-87
• 4.2.1 實驗原料與試劑80-82
• 4.2.2 實驗儀器與設(shè)備82
• 4.2.3 實驗方法82
• 4.2.4 氧化石墨烯及可生物剪切的陽離子基因載體SS-GPD的制備82-83
• 4.2.4.1 氧化石墨烯的制備82-83
• 4.2.4.2 可生物剪切的ATRP引發(fā)位點的引入83
• 4.2.4.3 可生物剪切的PDMAEMA功能化的氧化石墨烯的合成83
• 4.2.5 氧化石墨烯及陽離子基因載體SS-GPD的表征83-84
• 4.2.5.1 X射線光電子能譜測試83-84
• 4.2.5.2 原子力顯微鏡測試84
• 4.2.5.3 粒徑及Zeta電位測試84
• 4.2.5.4 樣品的分散性測試84
• 4.2.5.5 PDMAEMA鏈的分子量測試84
• 4.2.6 載體與DNA復(fù)合體的表征84-85
• 4.2.6.1 瓊脂糖凝膠電泳測試85
• 4.2.6.2 粒徑及Zeta電位測試85
• 4.2.6.3 顆粒形態(tài)測試85
• 4.2.7 載體的細胞毒性及轉(zhuǎn)染能力測試85-86
• 4.2.7.1 細胞毒性測試85-86
• 4.2.7.2 體外轉(zhuǎn)染效率測試86
• 4.2.8 載體的載藥能力測試86-87
• 4.3 結(jié)果與討論87-99
• 4.3.1 可生物剪切的陽離子基因載體SS-GPD的制備及表征87-91
• 4.3.2 載體與DNA復(fù)合體的表征91-94
• 4.3.3 載體的細胞毒性及轉(zhuǎn)染能力表征94-96
• 4.3.3.1 載體的細胞毒性測試94-95
• 4.3.3.2 體外基因轉(zhuǎn)染效率測試95-96
• 4.3.4 載體的載藥能力測試96-99
• 4.4 小結(jié)99-102
• 第五章 基于季戊四醇構(gòu)建高性能陽離子基因載體用于減輕小鼠心臟纖維化102-124
• 5.1 前言102-103
• 5.2 實驗部分103-108
• 5.2.1 實驗原料與試劑103-104
• 5.2.2 實驗儀器與設(shè)備104
• 5.2.3 實驗方法104
• 5.2.4 陽離子基因載體s-PGEA的制備104-105
• 5.2.5 載體的化學(xué)表征105
• 5.2.6 載體與miRNA復(fù)合體的生理物理學(xué)測試105-106
• 5.2.6.1 粒徑及Zeta電位測試106
• 5.2.6.2 原子力顯微鏡(AFM)測試106
• 5.2.6.3 載體的蛋白吸附實驗106
• 5.2.7 載體的轉(zhuǎn)染能力及細胞毒性測試106-107
• 5.2.7.1 細胞毒性測試106
• 5.2.7.2 體外基因傳遞效率測試106-107
• 5.2.8 載體攜帶miRNA減輕心臟纖維化的動物活體實驗107-108
• 5.2.8.1 驗證載體/miRNA復(fù)合體在心臟部位聚集107
• 5.2.8.2 載體/miRNA減輕小鼠心臟纖維化實驗107-108
• 5.3 結(jié)果與討論108-122
• 5.3.1 陽離子基因載體s-PGEA的制備及化學(xué)表征108-109
• 5.3.2 載體的生理物理學(xué)測試109-111
• 5.3.2.1 粒度及電位測試109-110
• 5.3.2.2 原子力顯微鏡(AFM)測試110-111
• 5.3.2.3 蛋白吸附實驗111
• 5.3.3 載體的轉(zhuǎn)染能力及細胞毒性測試111-116
• 5.3.3.1 細胞毒性測試111-113
• 5.3.3.2 基因傳遞能力測試113-116
• 5.3.4 載體攜帶miRNA減輕心臟纖維化的動物活體實驗116-122
• 5.3.4.1 驗證載體/miRNA在心臟部位聚集116-119
• 5.3.4.2 驗證載體/miRNA減輕小鼠心臟纖維化119-122
• 5.4 小結(jié)122-124
• 第六章 結(jié)論124-126
• 參考文獻126-144
• 致謝144-146
• 研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文146-148
• 作者簡介148-150
• 導(dǎo)師簡介150-151
• 博士研究生學(xué)位論文答辯委員會決議書151-152

  本文關(guān)鍵詞：甲基丙烯酸酯類高性能基因載體的構(gòu)建、制備與表征，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：422982