發(fā)布時間：2023-01-12 13:33

　　酰胺酶即酰胺水解酶,是一種能斷裂非肽鍵型酰胺鍵的一種水解酶。酰胺酶具有較高的催化活性、嚴(yán)格的立體選擇性和廣泛的底物譜等特性,使得越來越多的研究集中于酰胺酶在手性農(nóng)藥、手性藥物和手性氨基酸的合成中。L-草銨膦（L-PPT）是在吸水鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的一種天然產(chǎn)生的L型的含磷氨基酸,同時也是一種對環(huán)境無害的廣譜型、觸殺型、滅生性除草劑,具有重要的應(yīng)用前景。與傳統(tǒng)的化學(xué)法合成草銨膦相比,通過酰胺酶催化合成L-草銨膦的方法具有立體選擇性好、反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、后續(xù)分離純化操作簡便、環(huán)境友好等優(yōu)勢。本文通過產(chǎn)酶微生物菌株的篩選和酰胺酶基因挖掘等手段獲得了具有較高活力的立體選擇性的酰胺酶,并將其在枯草芽孢桿菌中實現(xiàn)了分泌表達(dá),研究了其酶學(xué)性質(zhì),并通過定向進化的方法對其酰胺酶活力進行了改造,應(yīng)用于L-草銨膦的合成中。主要研究內(nèi)容如下:（1）立體選擇性酰胺酶酶庫的構(gòu)建。建立了一個快速、高效、靈敏的高通量篩選方法用于催化生產(chǎn)草銨膦的相關(guān)產(chǎn)酶微生物及生物酶的篩選,運用此方法從土壤中篩選到了十株產(chǎn)酰胺酶的新菌株,其中有兩株菌株具有產(chǎn)高活力、高立體選擇性酰胺酶的能力:Kluyvera cryocrescens ... 

【文章頁數(shù)】：188 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 手性氨基酸概述
        1.1.1 手性氨基酸
        1.1.2 手性氨基酸的制備方法
    1.2 草銨膦概述
        1.2.1 草銨膦的生化功能
        1.2.2 DL-草銨膦的化學(xué)合成法
        1.2.3 L-草銨膦的化學(xué)合成
        1.2.4 L-草銨膦的生物合成
    1.3 酰胺酶
        1.3.1 酰胺酶簡介與分類
        1.3.2 酰胺酶的底物特異性與立體選擇性
        1.3.3 酰胺酶的篩選
        1.3.4 酰胺酶的克隆表達(dá)
        1.3.5 酰胺酶的分子改造
    1.4 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)
        1.4.1 枯草芽孢桿菌
        1.4.2 影響枯草芽孢桿菌表達(dá)因素簡介
        1.4.3 啟動子
        1.4.4 信號肽
    1.5 課題研究意義和主要研究內(nèi)容
        1.5.1 課題立項依據(jù)和研究意義
        1.5.2 研究內(nèi)容
第二章 立體選擇性酰胺酶的篩選
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 主要實驗試劑
        2.2.2 菌種質(zhì)粒及培養(yǎng)基
        2.2.3 實驗儀器與設(shè)備
        2.2.4 高通量篩選方法的建立
        2.2.5 立體選擇性酰胺酶產(chǎn)生菌的篩選
        2.2.6 產(chǎn)酶微生物菌株的鑒定
        2.2.7 枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.2.8 立體選擇性酰胺酶基因的挖掘
        2.2.9 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.10 酰胺酶全基因合成
        2.2.11 重組酰胺酶的表達(dá)與酰胺酶粗酶制備
        2.2.12 核酸與蛋白電泳
        2.2.13 酰胺酶催化底物轉(zhuǎn)化成L-PPT的轉(zhuǎn)化率與e.e.值測定
        2.2.14 L-草銨膦的含量與e.e.值分析
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 高通量篩選方法的建立與驗證
        2.3.2 酰胺酶產(chǎn)生菌的篩選與鑒定
        2.3.3 酰胺酶基因的挖掘
        2.3.4 產(chǎn)酰胺酶菌株中酰胺酶基因的克隆
        2.3.5 重組酰胺酶基因的分泌表達(dá)
    2.4 本章小結(jié)
第三章 酰胺酶在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 主要實驗試劑
        3.2.2 菌株試劑及培養(yǎng)基
        3.2.3 實驗儀器及設(shè)備
        3.2.4 枯草芽孢桿菌基因組提取
        3.2.5 枯草芽孢桿菌內(nèi)源啟動子與信號肽引物設(shè)計
        3.2.6 含有不同啟動子質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.7 單啟動子的篩選與表征
        3.2.8 雙啟動子構(gòu)建
        3.2.9 具備高效分泌效率的信號肽的篩選
        3.2.10 枯草芽孢桿菌的擴大培養(yǎng)
        3.2.11 酰胺酶文庫中酰胺酶的分泌表達(dá)
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 枯草芽孢桿菌內(nèi)源啟動子的篩選與表征
        3.3.2 Bm-Ami在枯草芽孢桿菌內(nèi)源性啟動子作用下的活力測定與表征
        3.3.3 Bm-Ami在枯草芽孢桿菌串聯(lián)雙啟動子作用下的活力測定與表征
        3.3.4 信號肽的篩選
        3.3.5 Bm-Ami在5 L發(fā)酵罐中的擴大生產(chǎn)
        3.3.6 酰胺酶文庫中酰胺酶的分泌表達(dá)
    3.4 本章小結(jié)
第四章 立體選擇性酰胺酶的酶學(xué)性質(zhì)分析
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 主要實驗試劑
        4.2.2 菌種質(zhì)粒及培養(yǎng)基
        4.2.3 實驗儀器與設(shè)備
        4.2.4 立體選擇性酰胺酶表達(dá)及純化
        4.2.5 重組酰胺酶酶活測定與蛋白含量測定
        4.2.6 重組酰胺酶酶學(xué)性質(zhì)的測定
        4.2.7 酰胺酶動力學(xué)參數(shù)的測定
        4.2.8 底物特異性
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 重組立體選擇性酰胺酶的序列結(jié)構(gòu)分析
        4.3.2 重組立體選擇性酰胺酶的系統(tǒng)發(fā)育分析
        4.3.3 重組立體選擇性酰胺酶的純化
        4.3.4 pH對酰胺酶酶活的影響及pH穩(wěn)定性
        4.3.5 溫度對酰胺酶酶活的影響及溫度穩(wěn)定性
        4.3.6 金屬離子、特殊化學(xué)物質(zhì)和有機溶劑對酶活的影響
        4.3.7 動力學(xué)參數(shù)的測定
        4.3.8 底物特異性
    4.4 本章小結(jié)
第五章 重組酰胺酶的分子改造
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 主要實驗試劑
        5.2.2 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基
        5.2.3 實驗儀器與設(shè)備
        5.2.4 酰胺酶Bm-Ami的同源建模
        5.2.5 酰胺酶模型YBm-Ami的活性口袋預(yù)測及分析
        5.2.6 酰胺酶突變文庫的構(gòu)建與篩選
        5.2.7 酰胺酶突變體動力學(xué)參數(shù)的測定
        5.2.8 酰胺酶突變體的分子對接分析
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 酰胺酶同源建模及活性口袋預(yù)測及分析
        5.3.2 酰胺酶突變文庫的建立及篩選
        5.3.3 組合突變和最優(yōu)突變株的確立
        5.3.4 動力學(xué)參數(shù)測定
        5.3.5 酰胺酶突變體的分子對接分析
    5.4 本章小結(jié)
第六章 立體選擇性酰胺酶在L-草銨膦合成中的應(yīng)用
    6.1 引言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 主要實驗試劑
        6.2.2 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基
        6.2.3 實驗儀器及設(shè)備
        6.2.4 生物催化劑的制備
        6.2.5 底物rac-4-[羥基(甲基)膦�；鵠-2-(2-苯乙�；�)-丁酸(rac-S)的合成
        6.2.6 立體選擇性酰胺酶催化底物合成L-草銨膦的條件研究
        6.2.7 不同底物濃度的反應(yīng)進程研究
        6.2.8 酰胺酶催化rac-S合成L-草銨膦
        6.2.9 L-草銨膦的分離純化
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 Rac-S的合成
        6.3.2 酰胺酶的制備
        6.3.3 酰胺酶催化rac-S合成L-草銨膦的條件優(yōu)化
        6.3.4 酰胺酶催化rac-S合成L-草銨膦的反應(yīng)進程研究
        6.3.5 酰胺酶催化rac-S合成L-草銨膦
        6.3.6 L-草銨膦的分離純化及D型底物的消旋化
        6.3.7 L-草銨膦的表征
    6.4 本章小結(jié)
第七章 結(jié)論與展望
    7.1 結(jié)論
    7.2 主要貢獻(xiàn)與創(chuàng)新
    7.3 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡介
    1 作者簡歷
    2 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
    3 參與的科研項目情況
    4 發(fā)明專利
學(xué)位論文數(shù)據(jù)集



本文編號：3729994