隨著現(xiàn)在人們工作節(jié)奏加快,過(guò)度性疲勞的病癥嚴(yán)重困擾著大量年輕人;由于現(xiàn)在人們的不良飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣,心腦血管等血栓性疾病在老年人當(dāng)中的發(fā)病率也與日俱增。但目前市面上還尚未有安全可靠的可食性產(chǎn)品來(lái)幫助人們改善這兩種多發(fā)病癥。因此,本文對(duì)抗凝血和抗疲勞活性肽的深入研究探討則顯得非常有實(shí)用意義。寬體金線蛭、東亞鉗蝎蛋白質(zhì)含量高,是一種理想的制備活性多肽的原料。本文以寬體金線蛭、東亞鉗蝎為原料,提取分離蛋白,通過(guò)酶法可控制備抗凝血、抗疲勞活性多肽,建立了最佳酶解工藝條件,并進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)功效論證,再進(jìn)行后續(xù)的分離純化、多肽序列測(cè)定,分析探討了氨基酸組成變化與多肽活性之間的關(guān)系,最后模擬多肽在體內(nèi)胃腸道的消化吸收實(shí)驗(yàn)。采用堿溶酸沉法對(duì)寬體金線蛭、東亞鉗蝎蛋白進(jìn)行了較高得率的提取。HPLC分析表明,寬體金線蛭分離蛋白WPI的分子量分布主要集中在4230 Da到92362 Da,東亞鉗蝎分離蛋白HPI的分子量分布主要集中在27510 Da到52436 Da范圍。采用酶制劑Alcalase AF 2.4L,Trypsin,Papain,Pepsin,Protamex,Flavourzyme等,探討了W... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 寬體金線蛭、東亞鉗蝎抗凝血研究現(xiàn)狀
        1.1.1 寬體金線蛭
        1.1.2 東亞鉗蝎
    1.2 生物活性肽
        1.2.1 生物活性肽的研究進(jìn)展
        1.2.2 生物活性肽的制備分離及鑒定
            1.2.2.1 活性肽制備方法
            1.2.2.2 國(guó)內(nèi)外酶法制備活性肽現(xiàn)狀
            1.2.2.3 生物活性肽的分離純化
            1.2.2.4 生物活性肽的鑒定研究
    1.3 凝血及抗凝機(jī)制
    1.4 抗凝血活性肽的研究現(xiàn)狀
    1.5 抗疲勞的研究
        1.5.1 抗疲勞的研究現(xiàn)狀
        1.5.2 疲勞的產(chǎn)生機(jī)理
        1.5.3 抗疲勞肽機(jī)理
        1.5.4 活性肽體外抗氧化與體內(nèi)抗疲勞之間的關(guān)聯(lián)
    1.6 本課題研究的立題依據(jù)和主要研究?jī)?nèi)容
        1.6.1 本課題的立題依據(jù)
        1.6.2 主要研究?jī)?nèi)容
第二章 寬體金線蛭、東亞鉗蝎分離蛋白的提取及理化性質(zhì)
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.2 主要儀器設(shè)備
        2.2.3 主要試劑
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 基本成分的測(cè)定
        2.3.2 寬體金線蛭分離蛋白(WPI)和東亞鉗蝎分離蛋白(HPI)的制備
        2.3.3 堿溶酸沉pH值確定
        2.3.4 分離蛋白提取率的計(jì)算
        2.3.5 分離蛋白的相對(duì)分子量分布
        2.3.6 分離蛋白的氨基酸組成分析
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 兩種原料的主要成分
        2.4.2 堿溶酸沉過(guò)程中pH值的確定
        2.4.3 兩種分離蛋白的相對(duì)分子量分布
        2.4.4 兩種分離蛋白的氨基酸組成分析
    2.5 本章小結(jié)
第三章 寬體金線蛭、東亞鉗蝎分離蛋白的酶解工藝研究
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 主要儀器設(shè)備
        3.2.3 主要試劑
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 酶解工藝過(guò)程
        3.3.2 Alcalase催化分離蛋白水解工藝優(yōu)化
        3.3.3 不同酶催化下分離蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性肽得率
            3.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
            3.3.3.2 可溶性肽含量測(cè)定
        3.3.4 酶解分離蛋白產(chǎn)物的相對(duì)分子量測(cè)定
        3.3.5 氨基酸組成測(cè)定
        3.3.6 酶標(biāo)儀測(cè)定抗凝血活性
            3.3.6.1 試劑配制
            3.3.6.2 抗凝血活性的測(cè)定
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 蛋白酶種類(lèi)對(duì)兩種分離蛋白WPI和HPI水解反應(yīng)的影響
            3.4.1.1 加酶量對(duì)兩種分離蛋白水解反應(yīng)的影響
            3.4.1.2 底物濃度對(duì)兩種分離蛋白水解反應(yīng)的影響
            3.4.1.3 水解時(shí)間對(duì)兩種分離蛋白水解反應(yīng)的影響
    3.5 六種酶水解底物蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性肽的得率
    3.6 酶解產(chǎn)物WA和HA的相對(duì)分子量分布
    3.7 酶解產(chǎn)物的氨基酸組成
    3.8 本章小結(jié)
第四章 兩種產(chǎn)物多肽的體內(nèi)抗血栓活性評(píng)價(jià)
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.2 主要儀器設(shè)備
        4.2.3 主要試劑
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 小鼠分組飼養(yǎng)
        4.3.2 小鼠造模
        4.3.3 抗凝血四項(xiàng)基本指標(biāo) (APTT, PT, TT, FIB)
            4.3.3.1 APTT測(cè)定
            4.3.3.2 TT測(cè)定
            4.3.3.3 PT測(cè)定
            4.3.3.4 FIB測(cè)定
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 各組小鼠的黑尾出現(xiàn)率
        4.4.2 各組小鼠的黑尾比
        4.4.3 各劑量多肽對(duì)小鼠凝血功能的影響
    4.5 本章小結(jié)
第五章 兩種產(chǎn)物多肽的抗氧化及抗疲勞活性評(píng)價(jià)
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.2 主要儀器設(shè)備
        5.2.3 主要試劑
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 產(chǎn)物多肽的抗氧化活性測(cè)定
            5.3.1.1 清除二苯代苦味�；�(DPPH·)能力的測(cè)定
            5.3.1.2 清除羥基自由基(·OH)能力的測(cè)定
            5.3.1.3 還原能力的測(cè)定
            5.3.1.4 對(duì)AAPH誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化性溶血的抑制率測(cè)定
        5.3.2 小鼠體內(nèi)抗疲勞實(shí)驗(yàn)
            5.3.2.1 小鼠分組飼養(yǎng)
            5.3.2.2 小鼠游泳訓(xùn)練
            5.3.2.3 小鼠力竭游泳實(shí)驗(yàn)
            5.3.2.4 小鼠體內(nèi)各生化指標(biāo)的測(cè)定
            5.3.2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 活性肽體外抗氧化指標(biāo)評(píng)價(jià)
            5.4.1.1 兩種酶解產(chǎn)物抑制自由基DPPH·的能力
            5.4.1.2 兩種酶解產(chǎn)物抑制自由基·OH的能力
            5.4.1.3 兩種酶解產(chǎn)物的還原能力
            5.4.1.4 兩種酶解產(chǎn)物抑制AAPH誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化性溶血的能力
        5.4.2 動(dòng)物體內(nèi)抗疲勞實(shí)驗(yàn)
            5.4.2.1 小鼠的體重變化
            5.4.2.2 灌胃物對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響
            5.4.2.3 灌胃物對(duì)小鼠肝、肌糖原的影響
            5.4.2.4 灌胃物對(duì)小鼠體內(nèi)血清乳酸(LD)形成的影響
            5.4.2.5 灌胃物對(duì)小鼠體內(nèi)血清尿素氮(BUN)的影響
            5.4.2.6 灌胃物對(duì)小鼠體內(nèi)血清肌酸激酶(CK)含量的影響
            5.4.2.7 灌胃物對(duì)小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)含量的影響
    5.5 本章小結(jié)
第六章 抗凝血多肽的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定
    6.1 引言
    6.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        6.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        6.2.2 主要儀器設(shè)備
        6.2.3 主要試劑
    6.3 實(shí)驗(yàn)方法
        6.3.1 DEAE sepharose FF陰離子交換柱的分離純化
        6.3.2 水解物的疏水值計(jì)算
        6.3.3 凝膠Sephadex G-15 層析分離
        6.3.4 制備型RP-HPLC柱分離活性肽
        6.3.5 溶血栓活性實(shí)驗(yàn)
        6.3.6 分離純化肽的氨基酸組成及疏水值測(cè)定
        6.3.7 多肽的MALDI-TOF-TOF MS序列測(cè)定
        6.3.8 模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)
    6.4 結(jié)果與討論
        6.4.1 酶解產(chǎn)物HA的分離純化
        6.4.2 酶解產(chǎn)物WA的分離純化
        6.4.3 組分WA_(3-1)的體外溶栓活性
        6.4.4 分離過(guò)程中各產(chǎn)物的氨基酸組成比較
        6.4.5 分離純化多肽組分WA_(3-1)和HA_(183B-8)的結(jié)構(gòu)鑒定
        6.4.6 模擬胃腸道消化對(duì)WA_(3-1), HA_(183B-8)的生物活性的影響
    6.5 本章小結(jié)
第七章 合成活性肽的體外模擬小腸吸收研究
    7.1 引言
    7.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        7.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        7.2.2 主要儀器設(shè)備
        7.2.3 主要試劑
    7.3 實(shí)驗(yàn)方法
        7.3.1 合成肽的純化及鑒定
        7.3.2 Caco-2 細(xì)胞模型的建立
        7.3.3 合成肽在Caco-2 細(xì)胞模型中的吸收實(shí)驗(yàn)
    7.4 結(jié)果與討論
        7.4.1 兩種合成肽的純化及鑒定
        7.4.2 合成肽在Caco-2 細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)
    7.5 本章小結(jié)
結(jié)論與展望
    一 結(jié)論
    二 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
    三 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀博士學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
附件



本文編號(hào)：3584457