本文關(guān)鍵詞：海灣扇貝酶解物的制備、鑒定及其體內(nèi)外抗腫瘤作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：海洋生物提取物多具有抗腫瘤活性,扇貝是海洋生物的一種,由于其營養(yǎng)價(jià)值高且含有多種生理活性成分,因此在海洋抗癌藥物研究中具有很好的應(yīng)用和開發(fā)前景。本研究以海灣扇貝為原料,研究了海灣扇貝酶解物的制備、鑒定、抗腫瘤作用及其可能機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.研究提出了海灣扇貝酶解物制備工藝條件,證明該酶解物具有較高的體外抗氧化活性。以去除內(nèi)臟的海灣扇貝肉為原料,按固液比(g:m L)1:6.25加水勻漿,按1312.82U/g加入酸性蛋白酶,調(diào)節(jié)p H值到3.53,50℃恒溫水解4 h,所得海灣扇貝酶解物的DPPH自由基清除率達(dá)到91.59%。進(jìn)一步研究結(jié)果表明,10 mg/m L該酶解物的紅細(xì)胞氧化溶血度(93.59%)與0.1 mg/m L Vc的紅細(xì)胞氧化溶血度(96.63%)差異不顯著,10 mg/m L該酶解物抗亞油酸過氧化能力(96.26%)顯著高于1.0 mg/m L Vc(67.74%)和0.1 mg/m L Vc(40.65%)的抗亞油酸過氧化能力(P㩳0.05),說明該酶解物具有較高的抗氧化活性。2.測(cè)定了海灣扇貝酶解物的氨基酸組成及含量,鑒定了該酶解物中海灣扇貝多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)。用柱前衍生反相高效液相色譜法測(cè)出海灣扇貝酶解物中包含14種游離氨基酸,多肽混合物中包含13種氨基酸,按含量由高到低依次為:精氨酸、半胱氨酸、組氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、脯氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸和亮氨酸。經(jīng)串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI TOF/TOF)鑒定,5個(gè)多肽組分的氨基酸序列分別為:組分1(m/z為706.3)Cys-Cys-Ser-His-Thr-Arg;組分2(m/z為718.3)Asn-Gly-Trp-Val-Thr-Arg;組分3(m/z為730.3)Gly-Asn-Pro-Met-Arg-Arg;組分4(m/z為741.4)Asp-His-Trp-Lys-Arg;組分5(m/z為908.5)Cys-Thr-Tyr-Gly-Pro-Val-Leu-Arg。3.研究了海灣扇貝酶解物對(duì)體外培養(yǎng)的兩種肝癌細(xì)胞的影響,證明該酶解物的體外抗腫瘤效果。CCK-8法測(cè)出不同濃度海灣扇貝酶解物均能顯著抑制人肝癌Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞的生長(P0.01),且抑制率隨酶解物濃度的升高而增加。其中,12mg/m L海灣扇貝酶解物組的抑制率分別為60.4%和64.2%,顯著高于其他組的抑制率(P0.01);經(jīng)倒置顯微鏡觀察,該組兩種細(xì)胞的形態(tài)較對(duì)照組均發(fā)生了明顯改變,表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、透明度降低、細(xì)胞核固縮等,并出現(xiàn)了凋亡小體;經(jīng)流式細(xì)胞儀分析,該組兩種細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著升高(P0.01);p53蛋白陽性率均顯著增高(P0.01),Bcl-2蛋白陽性率均顯著降低(P0.01)。由此可知,海灣扇貝酶解物體外抗腫瘤的作用機(jī)制可能為:①通過上調(diào)p53蛋白表達(dá),阻滯細(xì)胞周期,并經(jīng)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;②通過線粒體通路下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。4.研究了灌胃海灣扇貝酶解物對(duì)H22荷瘤小鼠的影響,證明該酶解物的體內(nèi)抗腫瘤效果。對(duì)H22荷瘤小鼠灌胃不同劑量的海灣扇貝酶解物后,低劑量組(500 mg/Kg·d-1)、中劑量組(1000 mg/Kg·d-1)和高劑量組(1500 mg/Kg·d-1)的抑瘤率分別為28.16%、41.93%和84.00%,具有量效依賴趨勢(shì)。與模型組相比,中劑量組小鼠血清中MDA和8-iso-PGF2α的水平顯著降低(P0.05),SOD、IL-2、IL-12、GSH-Px和TNF-α的水平顯著升高(P0.05);中劑量組小鼠腫瘤組織提取液中突變型p53、Survivin、MDA、8-OHd G和8-iso-PGF2α的水平顯著降低(P0.05),SOD和GSH-Px的水平顯著升高(P0.05)。腫瘤組織病理學(xué)觀察也表明該酶解物有較好的抗腫瘤生物學(xué)效應(yīng)。以上結(jié)果證明,海灣扇貝酶解物對(duì)小鼠肝癌H22具有明顯的抑制作用,且中劑量組效果較優(yōu)。由此可知,海灣扇貝酶解物體內(nèi)抗腫瘤的作用機(jī)制可能為:①通過提高機(jī)體的抗氧化能力和免疫功能而發(fā)揮作用;②通過調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子的水平,間接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;③通過降低某些凋亡抑制蛋白和腫瘤標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平,抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：海灣扇貝酶解物 氨基酸序列 抗腫瘤作用 H22荷瘤小鼠 肝癌細(xì)胞HepG2 肝癌細(xì)胞SMMC-7721
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TS254.1
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• abstract8-14
• 1 引言14-26
• 1.1 目的意義14-15
• 1.2 國內(nèi)外研究進(jìn)展15-23
• 1.2.1 概述15-16
• 1.2.2 海洋貝類在保健食品和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的利用現(xiàn)狀16-17
• 1.2.3 海洋貝類酶解物及抗腫瘤活性肽研究進(jìn)展17-19
• 1.2.4 海洋貝類活性肽制備技術(shù)研究進(jìn)展19
• 1.2.5 海洋貝類活性肽分離純化技術(shù)研究進(jìn)展19-20
• 1.2.6 活性肽的構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展20-21
• 1.2.7 海洋生物提取物抗癌作用機(jī)理21-23
• 1.3 主要研究內(nèi)容及技術(shù)路線23-26
• 1.3.1 主要研究內(nèi)容23-25
• 1.3.2 技術(shù)路線25-26
• 2 海灣扇貝酶解物制備及其體外抗氧化性研究26-42
• 2.1 材料與方法26-31
• 2.1.1 材料與試劑26
• 2.1.2 儀器設(shè)備26-27
• 2.1.3 試驗(yàn)方法27-30
• 2.1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)30-31
• 2.1.5 試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)方法31
• 2.2 結(jié)果與分析31-40
• 2.2.1 基本營養(yǎng)成分結(jié)果與分析31-32
• 2.2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析32-34
• 2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析34-39
• 2.2.4 體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果與分析39-40
• 2.3 討論40-41
• 2.3.1 自由基清除率與抗腫瘤活性的關(guān)系40
• 2.3.2 固液比對(duì)酶解效果的影響40-41
• 2.4 小結(jié)41-42
• 3 海灣扇貝酶解物的組成分析及結(jié)構(gòu)鑒定42-59
• 3.1 材料與方法42-46
• 3.1.1 材料與試劑42
• 3.1.2 儀器設(shè)備42-43
• 3.1.3 試驗(yàn)方法43-46
• 3.2 結(jié)果與分析46-57
• 3.2.1 海灣扇貝酶解物氨基酸組成及含量測(cè)定結(jié)果46-50
• 3.2.2 RP-HPLC分離結(jié)果50
• 3.2.3 海灣扇貝多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)果50-57
• 3.3 討論57
• 3.3.1 氨基酸組成及含量對(duì)海灣扇貝酶解物功能的影響57
• 3.3.2 海灣扇貝多肽結(jié)構(gòu)對(duì)其功能的影響57
• 3.4 小結(jié)57-59
• 4 海灣扇貝酶解物體外抗腫瘤活性及機(jī)制研究59-80
• 4.1 材料與方法59-62
• 4.1.1 材料與試劑59
• 4.1.2 儀器與設(shè)備59-60
• 4.1.3 試驗(yàn)方法60-62
• 4.2 結(jié)果與分析62-78
• 4.2.1 海灣扇貝酶解物對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞增殖的影響62-64
• 4.2.2 海灣扇貝酶解物對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞形態(tài)的影響64-68
• 4.2.3 海灣扇貝酶解物對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞凋亡的影響68-72
• 4.2.4 海灣扇貝酶解物對(duì)腫瘤細(xì)胞p53，Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響72-78
• 4.3 討論78-79
• 4.4 小結(jié)79-80
• 5 海灣扇貝酶解物體內(nèi)抗腫瘤活性及其機(jī)制研究80-97
• 5.1 材料和方法80-84
• 5.1.1 試驗(yàn)材料80
• 5.1.2 試驗(yàn)儀器80
• 5.1.3 飼養(yǎng)方案及受試方案80-81
• 5.1.4 H22肝癌移植瘤動(dòng)物模型的建立81
• 5.1.5 樣品采集81-82
• 5.1.6 小鼠各檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定82-84
• 5.1.7 小鼠腫瘤組織病理學(xué)觀察84
• 5.1.8 試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析84
• 5.2 結(jié)果與分析84-93
• 5.2.1 灌胃海灣扇貝酶解物對(duì)小鼠體重的影響84-85
• 5.2.2 灌胃海灣扇貝酶解物對(duì)小鼠成瘤及生長情況的影響85-86
• 5.2.3 灌胃海灣扇貝酶解物對(duì)小鼠腫瘤抑制率的影響86
• 5.2.4 灌胃海灣扇貝酶解物對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響86-87
• 5.2.5 灌胃海灣扇貝酶解物對(duì)小鼠血清學(xué)指標(biāo)的影響87-89
• 5.2.6 灌胃海灣扇貝酶解物對(duì)小鼠腫瘤組織提取液中各指標(biāo)的影響89-90
• 5.2.7 腫瘤組織病理學(xué)觀察90-93
• 5.3 討論93-96
• 5.3.1 H22肝癌移植瘤動(dòng)物模型的選擇及建立93
• 5.3.2 海灣扇貝酶解物對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響93-94
• 5.3.3 海灣扇貝酶解物對(duì)荷瘤小鼠抗氧化能力的影響94-95
• 5.3.4 海灣扇貝酶解物對(duì)荷瘤小鼠細(xì)胞因子的影響95
• 5.3.5 海灣扇貝酶解物對(duì)荷瘤小鼠中突變型p53 和生存素Survivin的影響95-96
• 5.4 小結(jié)96-97
• 6 結(jié)論與展望97-99
• 6.1 結(jié)論97-98
• 6.1.1 優(yōu)化并確定了酶法提取海灣扇貝酶解物的工藝條件97
• 6.1.2 確定了海灣扇貝酶解物具有較高的體外抗氧化活性97
• 6.1.3 測(cè)定了海灣扇貝酶解物的氨基酸組成及含量97
• 6.1.4 鑒定了海灣扇貝多肽（PAI）的一級(jí)結(jié)構(gòu)97
• 6.1.5 證明了海灣扇貝酶解物的體外抗腫瘤效果并預(yù)測(cè)了其機(jī)制97-98
• 6.1.6 證明了海灣扇貝酶解物的體內(nèi)抗腫瘤效果并預(yù)測(cè)了其機(jī)制98
• 6.2 展望98-99
• 參考文獻(xiàn)99-109
• 在讀期間已發(fā)表和待發(fā)表的學(xué)術(shù)論文109-110
• 作者簡歷110-111
• 致謝111-112

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  本文關(guān)鍵詞：海灣扇貝酶解物的制備、鑒定及其體內(nèi)外抗腫瘤作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：355785