發(fā)布時間：2021-08-17 05:30

　　α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase,α-Gal,EC 3.2.1.22）能專一性催化半乳低聚糖、多糖、糖脂及糖蛋白中α-1,6-半乳糖苷鍵的水解,在食品、飼料、醫(yī)藥及輕工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用,因此近年來對它的研究較多。但是α-Gal存在熱穩(wěn)定性差、催化效率低等問題,同時較低的產(chǎn)量也限制了其應(yīng)用。構(gòu)建出熱穩(wěn)定性良好、比酶活高、表達(dá)量高的α-Gal基因工程菌具有重要的研究意義。本研究成功地將源于水稻（Oryza sativa L.subsp.japonica var.Nipponbare）的riceα-Gal II基因通過a-凝集素錨定表達(dá)于釀酒酵母細(xì)胞表面,得到釀酒酵母表面展示（Yeast Surface Display,YSD）的全細(xì)胞催化單元YSD riceα-Gal II。省略了酶蛋白分離純化的步驟;優(yōu)化培養(yǎng)基組分及連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵提高了單位細(xì)胞表達(dá)的酶活力、細(xì)胞干重和總產(chǎn)量;優(yōu)勢輔因子的加入使表面展示基因工程菌的活性和穩(wěn)定性進(jìn)一步提高;通過理性設(shè)計(jì)、分子動力學(xué)模擬解析影響酶熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵功能氨基酸位點(diǎn),對擬突變體進(jìn)行分子動力學(xué)二次模擬篩選得到熱穩(wěn)定性良好的α-Gal突變... 

【文章來源】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：117 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

pYD1載體原理圖

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文19分子改造位點(diǎn)，進(jìn)行單點(diǎn)突變、N-端截短、loop區(qū)截短的擬突變體的二次分子動力學(xué)模擬預(yù)測，選擇正向突變體進(jìn)行實(shí)際突變，獲得熱穩(wěn)定性提高的riceα-GalII。（4）采用半柔性分子對接解析同源建模模板riceα-GalI、riceα-GalII及其突變體與不同底物的結(jié)合形式，進(jìn)一步闡明酶的催化機(jī)制。1.5技術(shù)路線圖1-2技術(shù)路線Figure1-2Thetechnicalrouteofthisstudy

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文27圖2-1基于pYD1系統(tǒng)的riceα-GalII釀酒酵母表面展示。（A）YSDriceα-GalII的免疫熒光染色，（B）YSDriceα-GalII的SDS-PAGE，Lane1為蛋白分子量，Lane2為EBY100，Lane3為EBY100/pYD1，Lane4為YSDriceα-GalIIFig2-1Yeastsurfacedisplayedriceα-GalIIbasedonpYD1system.(A)ImmunofluorescencestainingofYSDriceα-GalII,(B)ExpressionpatternoftheYSDriceα-GalIIdetectedbySDS-PAGE,Lane1,molecularmaker;Lane2,EBY100;Lane3,EBY100/pYD1;Lane4,YSDriceα-GalII2.2.2氮源對YSDriceα-GalII表達(dá)的影響氮源是蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)核酸合成的重要原料，參與微生物細(xì)胞自身蛋白和代謝產(chǎn)物構(gòu)成，分為有機(jī)氮源和無機(jī)氮源，選擇合適的氮源對酶的表達(dá)和菌體質(zhì)量的提高均十分重要。不同氮源對YSDriceα-GalII表達(dá)的影響見圖2-2A，精氨酸對YSDriceα-GalII的表達(dá)活性有明顯（p≤0.05）的抑制作用，盡管細(xì)胞干重顯著增加，但最終得到酶的總產(chǎn)量仍然大幅減少。而添加硫酸銨和尿素均顯著提高了酶的總產(chǎn)量（p≤0.05）。其中硫酸銨主要促進(jìn)了酵母細(xì)胞的生長，表現(xiàn)為細(xì)胞干重的顯著增加（p≤0.05），雖然酶活性略有降低，但總產(chǎn)量增加顯著。在釀酒酵母表達(dá)有機(jī)磷水解酶的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[6]α-半乳糖苷酶Aga2晶體結(jié)構(gòu)及八氫番茄紅素脫氫酶CrtIRa結(jié)晶條件研究[D]. 譚小芳.山東大學(xué) 2016
[7]表面展示外源蛋白的畢赤酵母細(xì)胞壁蛋白抽提及分析[D]. 周新瑩.華南理工大學(xué) 2012
[8]釀酒酵母表面展示解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的發(fā)酵工藝研究[D]. 段曉娟.華中科技大學(xué) 2011
[9]計(jì)算機(jī)輔助抗癌藥物設(shè)計(jì)和蛋白同源建模研究[D]. 黃曉艷.蘭州大學(xué) 2011



本文編號：3347156