本文關(guān)鍵詞：高靈敏度的毛細(xì)管凝膠電泳—紫外檢測(cè)核酸體系的建立及其在何首烏分子鑒定中的應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：靈敏度低是毛細(xì)管電泳技術(shù)分析核酸的關(guān)鍵難題,同時(shí)也是建立基于核酸檢測(cè)的毛細(xì)管電泳體系及其應(yīng)用的關(guān)鍵限制性因素。為解決靈敏度問(wèn)題,建立起高效、高靈敏分析核酸的毛細(xì)管電泳體系,本研究運(yùn)用場(chǎng)放大富集技術(shù)提高毛細(xì)管凝膠電泳-紫外檢測(cè)核酸靈敏度并將建立后的方法應(yīng)用于何首烏的分子鑒定,主要的研究成果如下:1通過(guò)充分閱讀文獻(xiàn)資料,深度調(diào)研了建立基于核酸檢測(cè)的毛細(xì)管凝膠電泳-紫外檢測(cè)體系存在的問(wèn)題、提出擬解決問(wèn)題的技術(shù)路線及高靈敏度的毛細(xì)管電泳體系建立后應(yīng)用于核酸分析的具體技術(shù)步驟。(1)提出運(yùn)用場(chǎng)放大富集技術(shù)解決毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)核酸靈敏度低的難題,其中首次提出將場(chǎng)放大富集細(xì)分為M-FASI和C-FASI兩種模式,并分析C-FASI可能獲得高靈敏度的機(jī)制。從而為解決關(guān)鍵的靈敏度問(wèn)題提供了技術(shù)路線、奠定了理論基礎(chǔ)。(2)提出高靈敏度的毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)核酸靈敏度體系建立后,應(yīng)與各種核酸分析策略結(jié)合,即優(yōu)化PCR策略+CE檢測(cè)兩個(gè)步驟,才能構(gòu)成完善的核酸分析體系,從而為建立后的毛細(xì)管電泳體系應(yīng)用于何首烏的分子鑒定提供技術(shù)路線。2運(yùn)用場(chǎng)放大樣品堆積(FASS)技術(shù)提高毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)核酸靈敏度,優(yōu)化的FASS條件為水柱注射(0.5 psi,40 s),樣品注射(25 psi,90 s),TE為樣品稀釋溶液,分離電壓-250 V/cm。優(yōu)化條件下,FASS與普通壓力注射模式(0.5 psi,10 s)相比,靈敏度提高665倍,DNA檢測(cè)限降至20 ng/m L。實(shí)驗(yàn)證明場(chǎng)放大富集效應(yīng)遠(yuǎn)高于稀釋效應(yīng),并據(jù)此提出了大量稀釋核酸樣品后再富集以檢測(cè)高鹽狀態(tài)核酸樣品的新策略。為驗(yàn)證該策略,未經(jīng)純化的?X174-HaeⅢ酶切消化的DNA產(chǎn)物測(cè)試FASS,FASS成功檢測(cè)出11條帶驗(yàn)證了FASS的有效性。方法的線性范圍為20-400 ng/m L,回歸方程為Y=92.10X-736.5,相關(guān)系數(shù)為0.999。峰面積和遷移時(shí)間的RSD分別為(1.07-5.36)和(0.04-0.91),表明FASS具有良好的定性、定量及穩(wěn)定性,是有效提高核酸檢測(cè)靈敏度的場(chǎng)放大富集模式之一3 FASS雖極大提高了進(jìn)樣量,但由于進(jìn)樣時(shí)間的增加及存于管中過(guò)長(zhǎng)的樣品柱對(duì)分離場(chǎng)強(qiáng)的干擾,造成分析時(shí)間的增加,且壓力法提高靈敏度的效果受限于管容積。因此,采用電動(dòng)注射模式的基質(zhì)場(chǎng)放大堆積注射(M-FASI)進(jìn)一步提高CGE-UV檢測(cè)核酸的靈敏度。優(yōu)化的M-FASI條件為:樣品稀釋溶液為(50μM tris-Hcl和5μM EDTA)/L的TE,樣品電動(dòng)注射(-10 k V,50 s),分離電壓250 V/cm。優(yōu)化條件下,M-FASI檢測(cè)DNA的檢測(cè)限(S/N=3)為4 ng/m L,靈敏度是常規(guī)電動(dòng)注射樣品(10 k V,10 s)的100倍,是FASS的4倍。M-FASI的富集效應(yīng)遠(yuǎn)大于稀釋效應(yīng),成功檢測(cè)未經(jīng)純化的?X174-HaeⅢ酶切消化的DNA產(chǎn)物驗(yàn)證了M-FASI的有效性。方法的線性范圍為20-134 ng/m L,遷移時(shí)間和峰面積的日間及日內(nèi)精密度分別為0.04-0.91和0.66-6.21,表明M-FASI的定性和定量良好,是分析微量DNA樣品的有效方法4電動(dòng)模式的M-FASI雖進(jìn)一步提高了靈敏度,但其存在樣品溶液(高場(chǎng)強(qiáng))與管口BGE(低場(chǎng)強(qiáng))的交界面易于受到擾動(dòng)、電動(dòng)注射樣品時(shí)間受限及焦耳熱干擾分離效率等問(wèn)題,為達(dá)到進(jìn)一步穩(wěn)定堆積界面并運(yùn)用毛細(xì)管凝膠電泳-紫外檢測(cè)高靈敏的分析微量核酸的目的,聯(lián)合使用基質(zhì)場(chǎng)放大和柱頭場(chǎng)放大堆積注射(C-FASI)以充分發(fā)揮兩種方法的優(yōu)勢(shì)并克服M-FASI和FASS的不足。在沒(méi)有降低分離度下,稀釋達(dá)30萬(wàn)倍的DNA樣品被C-FASI富集并檢測(cè)出來(lái),此時(shí),100-400 bp條帶(濃度最低)的檢測(cè)限為0.13 ng/m L(S/N=3)。此靈敏度為常規(guī)壓力進(jìn)樣的102308倍、常規(guī)電動(dòng)進(jìn)樣的3077倍、壓力場(chǎng)放大樣品堆積的154倍和基質(zhì)場(chǎng)放大堆積注射的31倍。C-FASI的富集效應(yīng)同樣遠(yuǎn)大于稀釋效應(yīng),線性范圍為0.8-20 ng/m L,峰的遷移時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.03-1.15和0.72-6.42。方法建立后,檢測(cè)未經(jīng)純化的?X174-Hae III酶切消化DNA,5000倍稀釋、總濃度為10 ng/m L的?X174-Hae III酶切消化DNA被C-FASI成功的富集并檢測(cè)。C-FASI檢測(cè)稀釋1000倍、未經(jīng)純化的400 bp PCR產(chǎn)物以進(jìn)一步驗(yàn)證其可用于實(shí)際核酸樣品分析,并在稀釋至6000倍時(shí)達(dá)到檢測(cè)限(S/N=3),峰的遷移時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.44和4.8。這些結(jié)果表明基于C-FASI的CGE-UV分析核酸的靈敏度高、定性和定量良好、操作簡(jiǎn)便、實(shí)用、可靠,是高效的核酸分析工具。5高靈敏度的CGE-UV分析核酸體系建立后,為驗(yàn)證體系的有效性,基于場(chǎng)放大富集的CGE-UV PCR-RFLP分子鑒定何首烏及其偽品,并與及傳統(tǒng)的平板凝膠電泳比較,實(shí)驗(yàn)顯示兩種方法均可有效鑒定何首烏及其偽品。但毛細(xì)管凝膠電泳的靈敏度是平板凝膠電泳的6000倍以上且具有分析效率達(dá)百萬(wàn)塔板以上、圖譜清晰、分析自動(dòng)化并可同步處理數(shù)據(jù)、清潔無(wú)污染、對(duì)操作者健康、性價(jià)比高、可定量且定性、定量精度良好等優(yōu)勢(shì),表明基于場(chǎng)放大富集的CGE-UV具有替代平板凝膠電泳分析DNA的巨大潛力。但由于PCR-RFLP步驟的耗時(shí)達(dá)5.5個(gè)小時(shí),不利于PCR-RFLP-CGE-UV分子鑒定體系快速鑒別何首烏。因此,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化鑒定方法的PCR策略。6 SNP-PCR代替PCR-RFLP與CGE-UV結(jié)合(SNP-PCR-CGE-UV)以高速鑒定何首烏,其能在23分鐘內(nèi)完成從PCR到DNA檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析全過(guò)程,是目前所有何首烏分子鑒定方法中速度最快的方法,并在PCR-RFLP-CGE-UV的基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低成本,是真正意義的上的高速、高通量和高性價(jià)比的何首烏分子鑒定體系。SNP-PCR-CGE-UV從PCR策略+DNA檢測(cè)方式兩方面優(yōu)化核酸分析體系,為CGE-UV在其它核酸分析領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一個(gè)范例,同時(shí)實(shí)驗(yàn)也顯示了基于場(chǎng)放大富集的CGE-UV替代平板凝膠電泳分析DNA的巨大潛力。從以上研究結(jié)果可以得出:場(chǎng)放大富集成功解決了毛細(xì)管凝膠電泳-紫外檢測(cè)核酸體系的靈敏度問(wèn)題并可用于實(shí)際的高鹽、微量核酸樣品的分析,已奠定了毛細(xì)管電泳技術(shù)在核酸分析領(lǐng)域應(yīng)用的基礎(chǔ)。何首烏分子鑒定中,CGE-UV與SNP-PCR結(jié)合的優(yōu)化過(guò)程也為毛細(xì)管電泳在其它核酸分析領(lǐng)域的應(yīng)用提供了范例和思路。這些顯示了高靈敏度的毛細(xì)管凝膠電泳-紫外檢測(cè)核酸體系在未來(lái)核酸分析中的巨大應(yīng)用潛力。
【關(guān)鍵詞】：毛細(xì)管電泳 靈敏度 場(chǎng)放大富集 核酸 何首烏
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R284;O658.9
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-16
• 第一章 緒論16-64
• 前言16
• 1 毛細(xì)管電泳的基本原理16-19
• 1.1 毛細(xì)管凝膠電泳17
• 1.2 分離度17-18
• 1.3 電滲流18
• 1.4 毛細(xì)管電泳的電泳類型18-19
• 2 毛細(xì)管電泳在核酸分析上的優(yōu)勢(shì)19-21
• 3 毛細(xì)管電泳技術(shù)在核酸分析領(lǐng)域的應(yīng)用21-31
• 3.1 細(xì)菌病原體的鑒定、基因分型和耐藥性研究22-23
• 3.2 病毒診斷23
• 3.3 遺傳性疾病診斷23-25
• 3.4 腫瘤診斷25-28
• 3.5 其它相關(guān)診斷28-29
• 3.6 RNA分析29-30
• 3.7 診斷新方法30-31
• 4 毛細(xì)管電泳技術(shù)在核酸分析上存在的問(wèn)題31-33
• 5 毛細(xì)管電泳場(chǎng)放大富集技術(shù)概述33-59
• 5.1 場(chǎng)放大富集的基本原則33-56
• 5.2 毛細(xì)管場(chǎng)放大富集技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，缺點(diǎn)和今后的發(fā)展趨勢(shì)56-59
• 6 技術(shù)路線59-60
• 7 課題的主要研究?jī)?nèi)容及目的60-64
• 第二章 場(chǎng)放大樣品堆積提高毛細(xì)管凝膠電泳-紫外檢測(cè)核酸靈敏度64-77
• 前言64
• 1.實(shí)驗(yàn)儀器、材料和方法64-66
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器64-65
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料65
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法65-66
• 2 結(jié)果與分析66-75
• 2.1 評(píng)估毛細(xì)管電泳體系的穩(wěn)定性66-67
• 2.2 場(chǎng)放大樣品堆積的機(jī)制67
• 2.3 常規(guī)壓力進(jìn)樣的檢測(cè)靈敏度67
• 2.4 場(chǎng)放大樣品堆積參數(shù)的優(yōu)化67-72
• 2.5 場(chǎng)放大樣品堆積的檢測(cè)靈敏度72
• 2.6 FASS的場(chǎng)放大富集效果遠(yuǎn)大于稀釋效應(yīng)72-73
• 2.7．FASS的線性，精密度和重復(fù)性73-75
• 3 本章小結(jié)75-76
• 4 FASS的不足76-77
• 第三章 基質(zhì)場(chǎng)放大堆積注射提高毛細(xì)管凝膠電泳-紫外檢測(cè)核酸靈敏度77-88
• 前言77
• 1.實(shí)驗(yàn)儀器、材料和方法77-79
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器77-78
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料78
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法78-79
• 2 結(jié)果和討論79-86
• 2.1 基質(zhì)場(chǎng)放大堆積注射的機(jī)制79
• 2.2 常規(guī)電動(dòng)進(jìn)樣的檢測(cè)靈敏度79-80
• 2.3 分離電壓的優(yōu)化80
• 2.4 基質(zhì)場(chǎng)放大堆積注射參數(shù)的優(yōu)化80-83
• 2.5 基質(zhì)場(chǎng)放大堆積注射的靈敏度83
• 2.6 M-FASI的場(chǎng)放大富集效應(yīng)遠(yuǎn)大于稀釋效應(yīng)83-85
• 2.7 M-FASI的線性，精密度和重復(fù)性85-86
• 3 本章小結(jié)86-87
• 4 M-FASI方法的不足87-88
• 第四章 聯(lián)合使用基質(zhì)場(chǎng)放大和柱頭場(chǎng)放大堆積注射提高毛細(xì)管凝膠電泳-紫外檢測(cè)核酸靈敏度88-114
• 前言88-89
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器、材料和方法89-92
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備89
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料89-91
• 1.3 方法91-92
• 2 結(jié)果與討論92-111
• 2.1 場(chǎng)放大富集技術(shù)的基本原理92
• 2.2 C-FASI的機(jī)制92-95
• 2.3 分離條件的優(yōu)化95-96
• 2.4 C-FASI條件的優(yōu)化96-101
• 2.5 C-FASI的富集效應(yīng)遠(yuǎn)大于稀釋效應(yīng)101-104
• 2.6 C-FASI與其它富集技術(shù)在提高核酸檢測(cè)靈敏度方面的比較104-107
• 2.7 C-FASI的線性、精密度和重復(fù)性107-111
• 3 結(jié)論111
• 4 討論111-113
• 5 本章小結(jié)113-114
• 第五章 基于場(chǎng)放大富集的CGE-UV在何首烏PCR-RFLP分子鑒定中的應(yīng)用114-132
• 前言114-115
• 1 實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)方法115-120
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料115-117
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備117-118
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法118-120
• 2 結(jié)果與分析120-126
• 2.1 ITS2序列的擴(kuò)增結(jié)果及序列分析120
• 2.2 ITS2序列的酶譜分析120-121
• 2.3 基于平板凝膠電泳的PCR-RFLP分子鑒定何首烏植物及其偽品121-122
• 2.4 基于毛細(xì)管凝膠電泳的PCR-RFLP分子鑒定何首烏及其偽品122-126
• 3 討論126-130
• 4 本章小結(jié)130-132
• 第六章 基于場(chǎng)放大富集的CGE-UV在SNP-PCR鑒定何首烏及其偽品中的應(yīng)用132-145
• 前言132-133
• 1 實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)方法133-136
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料133-134
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備134
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法134-136
• 2 結(jié)果與分析136-141
• 2.1 SNP特異性引物的設(shè)計(jì)136
• 2.2 PCR反應(yīng)條件的確定136-139
• 2.3 何首烏植物及中藥材特異性引物PCR鑒別139
• 2.4 基于毛細(xì)管凝膠電泳的SNP-PCR鑒定何首烏及其偽品139-141
• 3 討論141-144
• 4 本章小結(jié)144-145
• 結(jié)論與展望145-148
• 1 結(jié)論145-146
• 2 本論文的創(chuàng)新點(diǎn)146
• 3 展望146-148
• 參考文獻(xiàn)148-172
• 附錄172-174
• 攻讀博士學(xué)位期間取得的研究成果174-176
• 致謝176-177
• 附件177

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 嚴(yán)寒靜;房志堅(jiān);余世孝;;不同種源何首烏的ITS序列分析及其親緣關(guān)系研究[J];西北植物學(xué)報(bào);2008年05期

2 鄭傳進(jìn);陳念;趙樹(shù)進(jìn);;何首烏種特異DNA探針的篩選[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年13期

3 方微,張慧信,王綠婭,秦彥文,劉斌,武迎,何繼強(qiáng),王偉,杜蘭平;何首烏總甙抑制動(dòng)脈粥樣硬化病變形成[J];中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志;2005年02期

4 唐生斌,唐海燕,鄭貫中;六種制何首烏偽品的生藥鑒別[J];湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);1998年07期

5 陳吉炎,陳黎,黃良永,安志斌,童玉璽;何首烏及其混偽品理化鑒別[J];時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥;1999年05期

6 張瑞晨;劉斌;孫震曉;徐冬艷;;何首烏提取物對(duì)人正常肝細(xì)胞L02周期阻滯及凋亡的影響[J];中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào);2010年06期

7 張繼慶;萬(wàn)元蘭;;何首烏與其偽品芭蕉塊根的鑒別[J];現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué);1993年06期

8 劉玉萍,曹暉,小松ガ子,畢培曦;探針技術(shù)在中藥材品質(zhì)監(jiān)控方面的研究與應(yīng)用(英文)[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2001年06期

9 楚晉,葉翠飛,李林;二苯乙烯苷對(duì)癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶及大腦炎性反應(yīng)的影響[J];中藥新藥與臨床藥理;2004年04期

10 蔣超;張雅華;陳敏;袁媛;林淑芳;吳志剛;;基于雙向位點(diǎn)特異性PCR的金銀花真?zhèn)舞b別方法研究[J];中國(guó)中藥雜志;2012年24期

  本文關(guān)鍵詞：高靈敏度的毛細(xì)管凝膠電泳—紫外檢測(cè)核酸體系的建立及其在何首烏分子鑒定中的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：320862