納他霉素是一類多烯類抗生素,在食品和醫(yī)療上被廣泛用作抗真菌劑,由于工業(yè)菌發(fā)酵水平較低,限制其廣泛應(yīng)用。納他霉素合成過程為典型的I型PKS途徑,但其系列合成反應(yīng)如何高效鏈接、形態(tài)分化與合成途徑如何協(xié)同等機(jī)制至今未有清晰解析,本研究以納他霉素工業(yè)菌株恰塔努加鏈霉菌L10為研究對(duì)象,對(duì)其高效生物合成的分子機(jī)制進(jìn)行較為深入的研究,同時(shí)為工業(yè)菌高產(chǎn)改造提供了理論依據(jù)。首先解析了納他霉素合成途徑的后修飾機(jī)制。通過對(duì)其中5個(gè)后修飾酶編碼基因進(jìn)行遺傳改造,獲得了4,5-脫環(huán)氧脫糖納他霉素、4,5-脫環(huán)氧納他霉素、4,5-脫環(huán)氧-12-脫羧基-12-甲基納他霉素及其脫水化合物等納他霉素類似物,其中后2個(gè)為新化合物。生物指示試驗(yàn)結(jié)果顯示,其中后3個(gè)類似物具有一定的抗真菌活性。scnD的缺失株不產(chǎn)生納他霉素但積累高產(chǎn)量的4,5-脫環(huán)氧納他霉素,scnK, scnJ和scnC的缺失株均不產(chǎn)生納他霉素而累積大量的4,5-脫環(huán)氧脫糖納他霉素。scnG的缺失株也不產(chǎn)納他霉素,而產(chǎn)生4,5-脫環(huán)氧-12-脫羧基-12-甲基納他霉素及其脫水化合物。此外,scnG相連的scnF缺失株中納他霉素產(chǎn)量降低了53%,同源糖基轉(zhuǎn)... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞和術(shù)語表
第一章 緒論
    1.1 鏈霉菌的形態(tài)發(fā)育
    1.2 納他霉素生物合成研究進(jìn)展
        1.2.1 納他霉素的生物合成基因簇
        1.2.2 納他霉素內(nèi)酯環(huán)合成的起始
        1.2.3 納他霉素內(nèi)酯環(huán)合成的延伸
        1.2.4 納他霉素內(nèi)酯環(huán)的后修飾
    1.3 納他霉素生物合成調(diào)控機(jī)制
        1.3.1 途徑特異性調(diào)控因子
        1.3.2 全局多效調(diào)控
    1.4 次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高及其代謝酶的研究策略
        1.4.1 高表達(dá)正相關(guān)結(jié)構(gòu)基因
        1.4.2 敲除負(fù)相關(guān)結(jié)構(gòu)基因
        1.4.3 體外穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析次級(jí)代謝酶濃度的適配性
        1.4.4 體內(nèi)分析次級(jí)代謝酶的可用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子
    1.5 本文的研究?jī)?nèi)容及意義
        1.5.1 本文的研究?jī)?nèi)容
        1.5.2 本課題的意義
第二章 納他霉素合成途徑的后修飾機(jī)制解析
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 菌株
        2.2.2 質(zhì)粒
        2.2.3 引物
        2.2.4 主要儀器與設(shè)備
        2.2.5 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        2.2.6 常用試劑
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 S.chattanoogensis基因組DNA的抽提
        2.3.2 DNA片段的PCR擴(kuò)增
        2.3.3 DNA片斷的處理
        2.3.4 大腸桿菌質(zhì)粒抽提
        2.3.5 大腸桿菌Cosmid抽提
        2.3.6 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.3.7 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
        2.3.8 孢子懸液的制備
        2.3.9 S.chattanoogensis和E.coli ET12567的屬間接合轉(zhuǎn)導(dǎo)
        2.3.10 PCR-targeting基因敲除
        2.3.11 S chattanoogensis單交換突變株的獲得
        2.3.12 S.chattanoogensis雙交換突變株的獲得
        2.3.13 S.chattanoogensis發(fā)酵、產(chǎn)物處理、HPLC和ESI-MS檢測(cè)
        2.3.14 RNA的抽提、基因組DNA的消解、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR
        2.3.15 納他霉素生物指示試驗(yàn)
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 基因缺失株構(gòu)建與驗(yàn)證
        2.4.2 基因缺失株的回補(bǔ)菌株構(gòu)建與驗(yàn)證
        2.4.3 納他霉素生物合成過程中兩個(gè)中間代謝產(chǎn)物的鑒定
        2.4.4 scnD缺失株產(chǎn)物鑒定
        2.4.5 scnK、scnJ和scnC缺失株產(chǎn)物鑒定
        2.4.6 scnG缺失株產(chǎn)物鑒定
        2.4.7 scnF的缺失導(dǎo)致納他霉素產(chǎn)量下降
        2.4.8 外源糖基轉(zhuǎn)移酶回補(bǔ)scnK缺失株
        2.4.9 納他霉素類似物的抗真菌活性分析
    2.5 本章小結(jié)與討論
第三章 納他霉素高效生物合成的分子機(jī)制
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 菌株
        3.2.2 質(zhì)粒
        3.2.3 引物
        3.2.4 主要儀器與設(shè)備
        3.2.5 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        3.2.6 常用試劑
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 本章所用分子生物學(xué)操作與鏈霉菌培養(yǎng)條件等方法同2.3
        3.3.2 鏈霉菌重組蛋白的表達(dá)
        3.3.3 鏈霉菌總蛋白的提取及SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 系列誘導(dǎo)載體的構(gòu)建過程
        3.4.2 恰塔努加鏈霉菌egfp基因體內(nèi)綠色熒光表達(dá)
        3.4.3 最佳誘導(dǎo)濃度的確定
        3.4.4 最佳誘導(dǎo)劑添加時(shí)間的確定
        3.4.5 不同濃度的IPTG對(duì)恰塔努加鏈霉菌生長(zhǎng)和納他霉素產(chǎn)量的影響
        3.4.6 梯度控制糖基轉(zhuǎn)移酶ScnK的表達(dá)對(duì)納他霉素合成的影響
        3.4.7 梯度控制GDP-甘露糖脫氫酶ScnJ的表達(dá)對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響
        3.4.8 梯度控制氨基轉(zhuǎn)移酶ScnC的表達(dá)對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響
        3.4.9 梯度控制P450單加氧酶ScnD的表達(dá)對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響
    3.5 本章小結(jié)與討論
第四章 納他霉素高速生物合成途徑的構(gòu)建
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 菌株
        4.2.2 質(zhì)粒載體
        4.2.3 引物
        4.2.4 主要儀器與設(shè)備
        4.2.5 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 本章所用分子生物學(xué)操作與鏈霉菌培養(yǎng)條件等方法同2.3
        4.3.2 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 系列高表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程
        4.4.2 高表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶基因scnK對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響
        4.4.3 高表這P450單加氧酶對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響
        4.4.4 高親達(dá)GDP-甘露糖脫水酶和氨基轉(zhuǎn)移酶對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響
        4.4.5 組合高表達(dá)海藻糖胺合成及轉(zhuǎn)移相關(guān)酶對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響
        4.4.6 利用兩套位點(diǎn)特異性重組體系同時(shí)官表達(dá)scnK/C和scnZ)
        4.4.7 基因重姐菌株在轉(zhuǎn)錄水平上的qRT-PC民分析
        4.4.8 納他霉素高產(chǎn)菌株在工業(yè)培養(yǎng)基中發(fā)酵驗(yàn)證
        4.4.9 搖瓶發(fā)酵過程中pH值和還原糖濃度的時(shí)間曲線
        4.4.10 優(yōu)化pH對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響
        4.4.11 優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的萄荀糖濃度W提高納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量
        4.4.12 發(fā)酵罐小試發(fā)酵工藝放大
    4.5 本章小結(jié)與討論
第五章 合成途爸與形態(tài)分化的協(xié)同祝制
    5.1 前言
    5.2 實(shí)驗(yàn)材輯
        5.2.1 菌巧
        5.2.2 質(zhì)粒載體
        5.2.3 引物
        5.2.4 主要儀器與設(shè)備
        5.2.5 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        5.2.6 常用試劑
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 蛋白在大煩巧菌中的異源表達(dá)及純化
        5.3.2 凝膠阻滯電泳
        5.3.3 DNasel Footprinting
        5.3.4 基因患片分析
    5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)栗
        5.4.1 WhiG_(ch)序列分析
        5.4.2 wWG_(ch)突變株的構(gòu)建與驗(yàn)證
        5.4.3 WhiC_(ch)對(duì)形態(tài)分化的影口向
        5.4.4 WhiG_(ch)對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響
        5.4.5 ZJUL31菌株中巧/和內(nèi)W/的轉(zhuǎn)錄水平分析
        5.4.6 WhiG_(ch)直接結(jié)合到納他霉素合成基因啟動(dòng)子區(qū)
        5.4.7 WhiG_(ch)結(jié)合序列的確定
        5.4.8 轉(zhuǎn)錄水平受影響的基因
    5.5 本章小結(jié)與討論
第六章 本文研究成果及展望
    6.1 本文研究成果
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀博士學(xué)位期間的主要研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]納他霉素產(chǎn)生菌的誘變育種及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 閻永貞,魏曉東,那可,金媛媛,趙波,趙文杰.  中國抗生素雜志. 2013(05)

博士論文
[1]恰塔努加鏈霉菌中納他霉素生物合成調(diào)控機(jī)制研究[D]. 杜藝嶺.浙江大學(xué) 2011

碩士論文
[1]恰塔努加鏈霉菌納他霉素生物合成的途徑特異性調(diào)控機(jī)制研究[D]. 孫志豪.浙江大學(xué) 2013
[2]恰塔努加鏈霉菌磷酸雙組份系統(tǒng)功能研究[D]. 李善振.浙江大學(xué) 2011
[3]納他霉素高產(chǎn)菌株的構(gòu)建及其發(fā)酵工藝優(yōu)化[D]. 程良英.浙江大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3171894