發(fā)布時間：2017-04-14 02:12

  本文關鍵詞：酶的固定化及酶活性熒光分析檢測，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：酶是生物蛋白催化劑,它來源于自然界,并具有高效、專一的催化活性。伴隨著科學技術的發(fā)展,酶也在諸多領域得到了較為廣泛的應用。然而,來源于生命體的游離酶在高溫、有機溶劑或極端pH下的不穩(wěn)定性,使其在工業(yè)中的廣泛應用受到一定限制。此外,反應體系中游離酶分離和提純的難度較大,這也增加了其作為催化劑的使用成本。固定化酶技術有效地彌補了這些缺陷,成為解決游離酶利用問題的一個有效途徑,并且為酶的深入應用開辟了廣闊的前景。與游離酶相比,固定化酶不僅保持了其高效性和專一性的催化反應特性,還具有易分離回收、可重復使用、操作連續(xù)、制備工藝簡便、增強酶穩(wěn)定性等一系列優(yōu)點。石墨烯量子點(GQDs)是尺寸在10 nm以下的零維納米材料。相對于二維的石墨烯納米片和一維的石墨烯納米帶,它除了具有比表面積大、載流子遷移率高、化學穩(wěn)定性良好、對環(huán)境友好的特征之外,還具有量子限制效應和邊界效應的特點。相對于傳統(tǒng)的石墨類化合物,GQDs具有獨特的熒光性質,可以根據粒徑光致發(fā)射不同波長的熒光,吸引了各個領域研究者的關注。目前,GQDs已在生物醫(yī)藥、太陽能光電器件、發(fā)光二極管和生物酶傳感器等諸多領域有了越來越廣范的應用。本論文首先制備氨基化PGMA/EDMA微球,并分別通過SEM和壓汞法對微球表面形貌和孔徑分布進行了表征。隨后使用兩種不同的酶固定化方法,分別將α-淀粉酶和p-葡萄糖苷酶固定化到氨基功能化的微球上,并分別對酶的固定化條件和穩(wěn)定性進行了優(yōu)化和考察。隨后,利用碳化二亞胺(EDC)和N-琥珀羥基酰亞胺(NHS)的交聯(lián)化反應,分別將乙酰膽堿酯酶(AChE)和α-葡萄糖苷酶固定化到GQDs表面,并利用GQDs的熒光特性,建立基于GQDs熒光的納米生物酶傳感器,用于兩種酶的定量分析及其抑制劑篩選。主要研究內容及結論如下：1.采用單分散聚合法制備PGMA/EDMA微球,并用乙二胺作為氨基化試劑將氨基接枝在微球表面,隨后使用交聯(lián)劑戊二醛,將α-淀粉酶成功共價交聯(lián)固定化到氨基化微球上,固定化效率為35.1 mg/g。隨后對固定化酶的操作條件和穩(wěn)定性進行了研究。與游離酶相比,固定化酶的米氏常數(shù)和最大反應速率分別提高了12.94 mgmL-1和0.124 mmol mL-1min-1。同時耐酸性增強,90℃下的熱穩(wěn)定性由40%增加到61%,9次重復操作之后仍可保留58%的初始酶活性。最適宜條件下保存180 min后,固定化酶和游離酶的活力分別保持在80%和10%以上。2.對游離酶采用吸附、沉淀、交聯(lián)的順序,制備了聚合交聯(lián)固定化β-葡萄糖苷酶,并對制備固定化酶的操作條件進行了優(yōu)化。結果表明,固定化酶的兩個動力學參數(shù)值Km和vmax分別為7.67μm和0.639μmol mL-1min-1,表明固定化酶比游離酶更具底物親和性；最佳使用pH值和溫度分別為5.5和60℃；連續(xù)重復使用9次后,固定化酶剩余活性仍然保持在90%以上；70℃條件下水浴恒溫180 min后,固定化酶活力保持在80%以上,300 min后剩余50%初始活性；放置冰箱4℃儲存,30 d后固定化酶剩余初始活性達到80%以上。最后,用纖維二糖作為底物進行水解,相對于游離酶,固定化酶極大地提高了纖維二糖的水解速率,由4h縮短至1 h,具有潛在的食品和生物乙醇生產的實際應用價值。3.利用EDC和NHS的交聯(lián)作用,將AChE固定化到GQDs表面,同時GQDs的熒光也隨之增強。隨后用Hg2+將增強后的熒光猝滅,再利用酶解反應釋放的膽堿化合物和Hg2+作用,形成Hg-S鍵,將GQDs-Hg2+體系解離,釋放出GQDs,熒光得以恢復。根據以上原理設計了GQDs熒光納米生物酶傳感器,通過“熒光開關”現(xiàn)象建立了AChE的分析方法,線性范圍為10-5～10-2U,檢測限為2.3×10-6 U,并選用對氧磷和塔克林兩種AChE抑制劑,對體系進行了酶活性抑制實驗,得到兩種模型抑制劑的半數(shù)抑制有效濃度分別為63.76 nM和14.07 nM。證明了基于GQDs增強熒光的納米傳感器可以對AChE進行活性分析,并且可以作為潛在的AChE抑制劑篩選工具。4.利用EDC和NHS的交聯(lián)作用,將a-葡萄糖苷酶交聯(lián)固定化到GQDs表面,再向體系中加入酶底物pNPG,水解后產生pNP,猝滅GQDs的熒光,猝滅率與酶的加入量呈線性關系,建立了α-葡萄糖苷酶分析方法,計算得出a-葡萄糖苷酶的線性檢測范圍為10-3～10-1 U,檢測限為1.7×10-4 U。最后利用陽性藥物阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶進行了活性抑制實驗。實驗結果表明,GQDs熒光納米生物酶傳感器可以對α-葡萄糖苷酶進行高靈敏度的活性檢測,并且對其抑制劑的篩選具有進一步的利用價值。
【關鍵詞】：固定化酶 石墨烯量子點 熒光納米傳感器 抑制劑篩選 PGMA/EDMA微球
【學位授予單位】：陜西師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：O657.3;O629.8
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 第1章 緒論12-36
• 1.1 固定化酶(immobilized enzyme)概述12-18
• 1.1.1 固定化酶概念12
• 1.1.2 固定化酶的制備方法12-14
• 1.1.3 固定化酶的制備原則14-15
• 1.1.4 固定化酶的性質15
• 1.1.5 固定化酶的評價指標15-16
• 1.1.6 固定化酶的應用16-18
• 1.2 乙酰膽堿酯酶(AChE)概述18-21
• 1.2.1 AChE的分子形式18-19
• 1.2.2 AChE的基因分析19
• 1.2.3 AChE的應用19-20
• 1.2.4 AChE抑制劑20-21
• 1.3 α-淀粉酶概述21-25
• 1.3.1 α-淀粉酶的結構特征21-22
• 1.3.2 α-淀粉酶的性質22
• 1.3.3 α-淀粉酶的應用22-23
• 1.3.4 α-淀粉酶的活性檢測23-24
• 1.3.5 α-淀粉酶的固定化24-25
• 1.4 β-葡萄糖苷酶概述25-28
• 1.4.1 β-葡萄糖苷酶的來源25
• 1.4.2 β-葡萄糖苷酶的結構25-26
• 1.4.3 β-葡萄糖苷酶的分類26
• 1.4.4 β-葡萄糖苷酶的酶學性質26-27
• 1.4.5 β-葡萄糖苷酶的應用27
• 1.4.6 β-葡萄糖苷酶的固定化27-28
• 1.5 α-葡萄糖苷酶概述28-31
• 1.5.1 α-葡萄糖苷酶的來源28
• 1.5.2 α-葡萄糖苷酶的結構28
• 1.5.3 α-葡萄糖苷酶的理化性質28-29
• 1.5.4 α-葡萄糖苷酶的應用29
• 1.5.5 α-葡萄糖苷酶的抑制劑29-31
• 1.6 GQDs概述31-34
• 1.6.1 GQDs的制備31-33
• 1.6.2 GQDs的形貌表征33
• 1.6.3 GQDs的應用33-34
• 1.7 本論文研究內容及研究意義34-36
• 第2章 α-淀粉酶的固定化及其性質研究36-54
• 2.1 引言36-38
• 2.1.1 儀器與試劑37
• 2.1.2 主要試劑37-38
• 2.2 固定化載體的合成38-39
• 2.2.1 聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(P_(GMA/EDMA))微球的合成38-39
• 2.2.2 P_(GMA/EDMA)微球的修飾39
• 2.3 α-淀粉酶的固定化39
• 2.4 α-淀粉酶的活性測定39-40
• 2.5 α-淀粉酶的最適pH和溫度40
• 2.6 α-淀粉酶的穩(wěn)定性測試40-41
• 2.6.1 貯存穩(wěn)定性測試40
• 2.6.2 重復使用性測試40
• 2.6.3 熱穩(wěn)定性測試40
• 2.6.4 動力學參數(shù)測定40-41
• 2.7 結果與討論41-51
• 2.7.1 氨基化P_(GMA/EDMA)微球的表征41-43
• 2.7.2 固定化效率對比43
• 2.7.3 固定化條件的優(yōu)化43-45
• 2.7.4 pH值和溫度的優(yōu)化45-47
• 2.7.5 固定化酶和自由酶的穩(wěn)定性47-49
• 2.7.6 動力學參數(shù)對比49-51
• 2.8 本章小結51-54
• 第3章 β-葡萄糖苷酶的固定化及其性質研究54-68
• 3.1 引言54
• 3.2 實驗部分54-57
• 3.2.1 主要試劑54-55
• 3.2.2 聚合交聯(lián)固定化β-葡萄糖苷酶的制備55
• 3.2.3 酶活性的測定55
• 3.2.4 測定酶活的最優(yōu)化條件55-56
• 3.2.5 動力學參數(shù)測定56
• 3.2.6 穩(wěn)定性測試56
• 3.2.7 纖維二糖的水解56-57
• 3.3 結果與討論57-66
• 3.3.1 β-葡萄糖苷酶固定化條件的選擇57-60
• 3.3.2 聚合交聯(lián)β-葡萄糖苷酶應用條件的選擇60-62
• 3.3.3 固定化酶和游離酶的穩(wěn)定性測試62-65
• 3.3.4 纖維二糖的水解65-66
• 3.4 本章小結66-68
• 第4章 基于增強熒光的GQDs納米傳感器用于乙酰膽堿酯酶的傳感及其抑制劑篩選68-78
• 4.1 引言68
• 4.2 實驗部分68-69
• 4.2.1 實驗試劑68-69
• 4.2.2 AChE的固定化69
• 4.2.3 AChE的檢測69
• 4.2.4 抑制劑對AChE的活性影響69
• 4.3 結果與討論69-76
• 4.3.1 GQDs的表征69-70
• 4.3.2 AChE的固定化及熒光增強70-71
• 4.3.3 檢測AChE活性的條件優(yōu)化71-73
• 4.3.4 AChE活性檢測73-74
• 4.3.5 AChE的抑制劑檢測74-76
• 4.4 小結76-78
• 第5章 基于增強GQDs熒光的α-葡萄糖苷酶檢測及其抑制劑篩選78-86
• 5.1 引言78
• 5.2 實驗部分78-79
• 5.2.1 實驗試劑78
• 5.2.2 α-葡萄糖苷酶的活性測定78-79
• 5.2.3 GQDs的增強熒光79
• 5.2.4 pNP對GQDs的熒光猝滅79
• 5.2.5 α-葡萄糖苷酶酶活性分析79
• 5.3 結果與討論79-85
• 5.3.1 酶促反應的條件優(yōu)化79-81
• 5.3.2 pNP的熒光猝滅作用81-82
• 5.3.3 熒光法檢測α-葡萄糖苷酶活性82-84
• 5.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選84-85
• 5.4 小結85-86
• 第6章 總結86-88
• 參考文獻88-102
• 致謝102-104
• 攻讀博士學位期間研究成果104

  本文關鍵詞：酶的固定化及酶活性熒光分析檢測，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：304979