厭氧氨氧化是地球氮循環(huán)的重要組成部分,也是污水生物脫氮和環(huán)境修復(fù)的重要基礎(chǔ),釋放到大氣中大約50%的氮可以歸因于厭氧氨氧化活動。作為厭氧氨氧化的執(zhí)行者,厭氧氨氧化細菌近年來已成為微生物、環(huán)境、地質(zhì)等領(lǐng)域的研究熱點,但對厭氧氨氧化細菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)的研究仍處于起步階段。特別是厭氧氨氧化細菌基因組中含有納米艙基因位點,然而對于厭氧氨氧化細菌的納米艙的功能和結(jié)構(gòu)了解甚少。通過透射電鏡觀察厭氧氨氧化細菌的精細結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)在其外部存在一些類似于蛋白籠結(jié)構(gòu)的同心圓環(huán)結(jié)構(gòu),其直徑在50-60nm。然后設(shè)計一種新的方法（溶菌酶+磷脂酶）對厭氧氨氧化細菌內(nèi)部物質(zhì)進行分離,利用透射電鏡發(fā)現(xiàn)在其內(nèi)部也存在類似蛋白籠的結(jié)構(gòu),其直徑在55-150nm之間。蛋白質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)也說明厭氧氨氧化細菌內(nèi)存在納米艙殼蛋白（cEnc）和載體蛋白（HAO）。綜上推測在厭氧氨氧化細菌內(nèi)部應(yīng)該存在納米艙。利用分子生物學的方法將納米艙殼蛋白在大腸桿菌中進行表達,純化,并基于透射電鏡和原子力掃描電鏡發(fā)現(xiàn)殼蛋白能夠在體外自組裝形成穩(wěn)定的直徑在34nm左右的球狀顆粒。然后利用200KeV冷凍電鏡解析球狀顆粒的精細結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)在其內(nèi)部還形成一個23n... 

【文章來源】：中國科學院大學(中國科學院重慶綠色智能技術(shù)研究院)重慶市

【文章頁數(shù)】：164 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

NIR與c Enc-NIR的異源表達A SDS-PAGE分析B封裝NIR酶的納米艙的結(jié)構(gòu)C,D NIR和c Enc-NIR氨基酸序列經(jīng)胰蛋白酶消化和質(zhì)譜分析檢測到的序列片段(紅色所示)

6.3.2 亞硝酸鹽對模式菌活性的影響通過前面的實驗可以看出,c Enc和NIR能夠在模式生物大腸桿菌中進行正常表達。為了深入研究封裝NIR酶的納米艙的功能,首先對與c Enc結(jié)合的NIR的結(jié)構(gòu)進行分析。通過利用Swiss建模分析,NIR與SMTL編號為4wtq.1的蛋白之間的相似度達到35%(如圖6.4A所示)。然后通過分析可以發(fā)現(xiàn)在NIR模型是一種三聚體蛋白(圖6.4B),其結(jié)構(gòu)活性中心含有9個銅(II)離子(非共價鍵),2個氧原子(非共價鍵),1個甘油結(jié)合位點(非功能性粘合劑)(圖6.4C箭頭所示)。由此可以推測異源表達NIR酶應(yīng)該需要額外補充銅(II)離子作為輔基。

通過前面的實驗可以看出,c Enc和NIR能夠在模式生物大腸桿菌中進行正常表達。為了深入研究封裝NIR酶的納米艙的功能,首先對與c Enc結(jié)合的NIR的結(jié)構(gòu)進行分析。通過利用Swiss建模分析,NIR與SMTL編號為4wtq.1的蛋白之間的相似度達到35%(如圖6.4A所示)。然后通過分析可以發(fā)現(xiàn)在NIR模型是一種三聚體蛋白(圖6.4B),其結(jié)構(gòu)活性中心含有9個銅(II)離子(非共價鍵),2個氧原子(非共價鍵),1個甘油結(jié)合位點(非功能性粘合劑)(圖6.4C箭頭所示)。由此可以推測異源表達NIR酶應(yīng)該需要額外補充銅(II)離子作為輔基。為了驗證NIR酶是否可以輔助細菌降解亞硝酸鹽,使用分子生物學方法建立了兩種不同類型的細菌,其中一種是帶有pET-28a-NIR融合質(zhì)粒的工程菌(EB),其能在誘導劑的條件下進行NIR的表達,另一種是不含pET-28a-NIR融合質(zhì)粒的野生菌(WB)。利用野生型菌和工程菌按照1:50比例接種到新的5 mL LB培養(yǎng)基中。然后在恒溫搖床中進行培養(yǎng),溫度為37℃,轉(zhuǎn)速設(shè)定為180 rpm,培養(yǎng)2小時左右,使培養(yǎng)基細菌濃度OD600達到0.5-0.7左右。然后設(shè)置三組實驗,對照組(WB)為野生菌,但在培養(yǎng)集中添加50 mg L-1亞硝氮。實驗組1(WB+NO2-)也為野生菌,但在培養(yǎng)集中添加CuCl2(終濃度為0.1 m M),50 mg L-1亞硝氮。實驗組2(EB+NO2-)為工程菌,然后在含有工程菌的培養(yǎng)基中加入IPTG誘導劑,并使其終濃度為0.1 mM,誘導工程菌產(chǎn)生NIR蛋白,并添加CuCl2(終濃度為0.1 mM),50 mg L-1亞硝氮。然后觀察不同組大腸桿菌的生長量。如圖6.5A所示,在實驗進行的第一階段,WB、WB+NO2-和EB+NO2-三者之間細菌的生長量是一致的。在第二階段,當在WB+NO2-和EB+NO2-的培養(yǎng)基中分別加入CuCl2和亞硝氮后,與對照組相比,細菌的生長活性受到抑制。通過對比WB和WB+NO2-細菌的生長量的變化,可以看出NO2-的存在并不會對野生型細菌的生長產(chǎn)生抑制作用,有可能是因為銅(II)離子的存在導致細菌活性受到抑制。通過分析可以看出銅(II)離子能與NO2-形成絡(luò)合物[Cu(NO2)4]2-,由此推測這種絡(luò)合物可能會對細菌產(chǎn)生毒害作用。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]厭氧氨氧化菌的種類、特性與檢測[J]. 胡倩怡,鄭平,康達.  應(yīng)用與環(huán)境生物學報. 2017(02)
[2]基于宏基因組技術(shù)獲得的對厭氧氨氧化菌代謝的新理解[J]. 丁爽,鄭平,陸慧鋒,唐崇儉.  應(yīng)用與環(huán)境生物學報. 2012(04)



本文編號：3049227