Y-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是谷氨酸(Glutamic acid, Glu)經(jīng)谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)催化脫羧生成的產(chǎn)物。GABA作為哺乳動物體內(nèi)一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有鎮(zhèn)靜安神、利尿、降血壓等多種生理功能,可作為生物活性因子應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和飼料工業(yè)。此外,GABA還可作為前體物質(zhì)來合成聚酰胺-4(可生物降解材料)等化工產(chǎn)品。本研究采用基因工程手段和細(xì)胞透性化技術(shù)對GABA高產(chǎn)菌Lactobacillus brevis CGMCCNO.1306和GAD工程菌BL21(DE3)-pET28a-gadB的GABA合成能力進(jìn)行強(qiáng)化研究,并在此基礎(chǔ)上,將谷氨酸脫羧反應(yīng)與乳酸發(fā)酵進(jìn)行耦合來同時制備GABA和乳酸,主要結(jié)果如下：1.以Lb. brevis CGMCC NO.1306為研究對象,采用增加其GABA合成系統(tǒng)關(guān)鍵基因所在操縱子拷貝數(shù)的方式來提高其GABA合成能力。對Lb. brevis CGMCC NO.1306基因組中涉及GABA合成的兩個操縱子(gadRAC operon和gadB operon)進(jìn)行了克隆和序列測定,發(fā)現(xiàn)這兩個操縱子與Lb. brevis ATCC 367相關(guān)序列的同源性都高達(dá)99%。利用熒光定量PCR技術(shù)考察了在控酸發(fā)酵條件下Lb. brevis CGMCC NO.1306 GABA合成系統(tǒng)中各個相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄情況,發(fā)現(xiàn)該菌GABA合成能力與gadRCA操縱子上的GAD抗酸系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄促進(jìn)因子gadR.GAD基因gadA和Glu-GABA反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因gadC的表達(dá)水平成正相關(guān),而單獨(dú)處于另一操縱子的GAD基因gadB的表達(dá)則與菌體GABA合成能力關(guān)系不大。在Lb. brevis CGMCC NO.1306中增加gadRCA操縱子的拷貝數(shù)后,工程菌的表觀GAD催化活力較原始菌得到明顯提高,且其活性在各個時期都明顯高于同期原始菌。發(fā)酵24 h時,工程菌表觀GAD活力達(dá)到最大值為0.86 U/mg,是同期原始菌的1.23倍。2.以BL21 (DE3)-pET28a-gadB為研究對象,在其內(nèi)強(qiáng)化Glu-GABA反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因gadC的表達(dá),可以有效地促進(jìn)底物Glu和產(chǎn)物GABA進(jìn)行跨膜運(yùn)輸,從而削弱了細(xì)胞被膜對底物和產(chǎn)物跨膜運(yùn)輸?shù)膫髻|(zhì)阻力,重組子BL21 (DE3)-pET28a-gadBC鍓的表觀GAD催化活力較BL21 (DE3)-pET28a-gadB的提高了2.6倍。但實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)Glu-GABA反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過量表達(dá)會對菌體生長產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制效應(yīng),從而削弱了菌體表觀GAD催化活力提高的正效應(yīng),表現(xiàn)為單位體積BL21 (DE3)-pET28a-gadBC發(fā)酵液中菌體的總表觀GAD催化活力只比單位體積BL21(DE3)-pET28a-gadB發(fā)酵液的提高了1.39倍。3.采用有機(jī)溶劑、表面活性劑、細(xì)胞壁合成抑制劑、熱處理和表達(dá)膜激肽(麥芽糖-蛙皮素融合蛋白)等多種細(xì)胞透性化方法來削弱BL21 (DE3)-pET28a-gadB細(xì)胞被膜對底物和產(chǎn)物跨膜運(yùn)輸?shù)膫髻|(zhì)阻力,從而為其表觀GAD催化活力的改善尋求了更為有效的方法。(1)采用有機(jī)溶劑對BL21(DE3)-pET28a-gadB進(jìn)行透性化處理時,有機(jī)溶劑的疏水性與菌體表觀GAD活力提高倍數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān),最有效的有機(jī)溶劑己烷在優(yōu)化的處理?xiàng)l件下(1%己烷處理菌體5 min),可使菌體表觀GAD活力提高9.65倍；(2)在所用的表面活性劑中,Triton X-100能最為有效地提高BL21(DE3)-pET28a-gadB的表觀GAD催化活力,1% TritonX-100處理菌體5 min,可使菌體表觀GAD活力提高10.8倍；(3)當(dāng)用5μg/mL氨芐青霉素對BL21(DE3)-pET28a-gadB進(jìn)行透性化處理時,菌體表觀GAD催化活力可以提高6.42倍,但該方法會導(dǎo)致菌體生物量降低40.3%；(4)70℃條件下熱處理BL21 (DE3)-pET28a-gadB菌體30 min,可使菌體表觀GAD催化活力提高13.05倍,達(dá)到9.08 U/mmg(細(xì)胞干重),且沒有出現(xiàn)GAD泄露現(xiàn)象；(5)表達(dá)麥芽糖-蛙皮素融合蛋白的透性化方法對BL21 (DE3)-pET28a-gadB的表觀GAD催化活力沒有明顯改善效果。由于熱處理可以最為有效的改善BL21 (DE3)-pET28a-gadB菌體的表觀GAD催化活力,同時熱處理不需要添加處理試劑,可以避免有毒物質(zhì)的引入,且易于操作和放大,因此選擇在70℃處理菌體30 mmin作為制備BL21 (DE3)-pET28a-gadB菌體催化劑的透性化處理方式。4.采用海藻酸鈉-CaCl2法對經(jīng)熱處理制備的透性化BL21 (DE3)-pET28a-gadB菌體進(jìn)行固定化,在菌體密度為9.28mg/mL、pH4.8、溫度50℃、50mM CaCl2和0.1mM PLP的條件下,固定化細(xì)胞經(jīng)過20批次共80 h反應(yīng)后,其相對轉(zhuǎn)化率能保持在最初的60%以上。將固定化細(xì)胞存放在4℃的無菌水中,其催化活力在一個月后仍能保持在90%以上。5.將固定化BL21 (DE3)-pET28a-gadB菌體催化的Glu脫羧反應(yīng)與米根霉乳酸發(fā)酵進(jìn)行耦合來同時制備GABA和乳酸,當(dāng)耦合反應(yīng)的pH控制在4.7-5.0之間時,GABA的產(chǎn)量可以達(dá)到44.8 g/L,且Glu到GABA的摩爾轉(zhuǎn)化率為96.5%,乳酸的產(chǎn)量可以達(dá)到80.2 g/L,葡萄糖到乳酸的產(chǎn)率為67.0%。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：TQ226.36

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王金玲;袁軍;劉登才;;γ-氨基丁酸的合成[J];化學(xué)與生物工程;2010年03期

2 盧定強(qiáng),韋萍,周華,賈紅華,歐陽平凱;生物催化與生物轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展[J];化工進(jìn)展;2004年06期

3 何娜;葉曉楓;李麗倩;李廣勝;陳沁濱;韓永斌;;不同脅迫處理方法對結(jié)球甘藍(lán)GABA含量的影響[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2013年06期

4 劉治軍,胡欣;促智藥奧拉西坦的臨床和基礎(chǔ)研究[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2005年03期

5 楊東元;陳開勛;王亞紅;;γ-氨基丁酸的合成研究[J];中國飼料;2010年01期

6 申迎賓;范子劍;王顯生;麻浩;;萌芽時間、溫度以及不同浸泡液對萌芽豇豆γ-氨基丁酸含量的影響[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2009年04期

7 林智,林鐘鳴,尹軍峰,譚俊峰;厭氧處理對茶葉中γ-氨基丁酸含量及其品質(zhì)的影響[J];食品科學(xué);2004年02期

8 許艷,萬敏,程巖,張培因,吳秀麗,王燕媚,王麗穎;重組人白細(xì)胞介素-4融合蛋白在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的影響因素[J];中國生物制品學(xué)雜志;2004年06期

9 謝海玉;龐中存;黃玉龍;;浸泡條件和萌芽條件對小扁豆中γ-氨基丁酸合成的影響[J];食品科學(xué);2013年02期

10 沈強(qiáng);潘科;鄭文佳;羅顯揚(yáng);張建;;厭氧/好氧處理對茶葉中GABA含量富集及其品質(zhì)的影響研究[J];西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年09期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 吳學(xué)鳳;米根霉半連續(xù)高強(qiáng)度發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸研究[D];合肥工業(yè)大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 后家衡;高產(chǎn)γ-氨基丁酸紅曲霉菌株的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[D];浙江師范大學(xué);2008年

本文編號：2816326