細(xì)胞是生物體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單元,其中存在一些具有特殊生理功能的活性小分子物質(zhì),如活性氮分子(RNS)和活性氧分子(ROS)等。它們是一類含氮或含氧自由基或分子,對于脂類、蛋白質(zhì)以及核酸分子均有較高反應(yīng)活性�；诩�(xì)胞內(nèi)RNS和ROS的濃度,它們既可以充當(dāng)“朋友”亦可以是“敵人”,其濃度處于正常值時,參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、控制細(xì)胞的增殖、分化與凋亡、促進(jìn)多種因子細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的啟動;而當(dāng)平衡打破,其濃度升高時,則會引起氧化應(yīng)激、導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、引起DNA的氧化損傷、介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性等,進(jìn)一步造成細(xì)胞癌變和死亡、腫瘤發(fā)生和發(fā)展、甚至心血管疾病等。鑒于此,原位實時定量檢測活細(xì)胞釋放RNS和ROS,不僅能幫助我們從分子水平理解它們介導(dǎo)生理過程,而且有助于我們揭示其引發(fā)相關(guān)疾病的機(jī)制,從而進(jìn)行疾病早期檢測、預(yù)防及選擇適當(dāng)?shù)闹委煼椒�。然�?RNS和ROS的實時靈敏檢測極具挑戰(zhàn)性,其釋放的量很少且半衰期短、活性高、易與生物環(huán)境中其他分子發(fā)生反應(yīng)。因此,構(gòu)建有效、靈敏的檢測平臺及生物相容性良好的細(xì)胞生長平臺是RNS和ROS原位檢測的關(guān)鍵。電化學(xué)方法操作簡便、特異性強(qiáng)、響應(yīng)快、靈敏度高且成本低,因而成為細(xì)胞釋放活性小分子檢測的常用技術(shù)手段。碳材料如碳納米管、石墨烯等被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)平臺的建設(shè)及細(xì)胞相關(guān)實驗的研究。本論文設(shè)計并合成了功能納米材料協(xié)同催化的仿生酶,提高了檢測穩(wěn)定性和選擇性,并構(gòu)筑了具有生物兼容性和特異催化活性的納米界面,實現(xiàn)了高靈敏度活細(xì)胞釋放RNS和ROS小分子的實時動態(tài)檢測,并深入探討了其催化機(jī)理。在此ii基礎(chǔ)上,進(jìn)一步構(gòu)建了活細(xì)胞直接生長的2d及3d自支撐傳感膜,并系統(tǒng)研究了該傳感膜的細(xì)胞粘附及電化學(xué)性能,結(jié)果表明將細(xì)胞直接生長在傳感膜上可以大大提高檢測的靈敏度。主要內(nèi)容及結(jié)果歸納如下:1.no是眾多癌細(xì)胞病變過程中釋放的一種信號傳導(dǎo)分子。然而,由于no極易擴(kuò)散、濃度低、壽命短,實現(xiàn)no的實時檢測仍是極大的挑戰(zhàn)。本工作通過水熱法合成了形貌可控的還原氧化石墨烯-二氧化鈰納米復(fù)合物(rgo-ceo2),并用它來構(gòu)建高靈敏的no實時檢測傳感器。rgo-ceo2納米復(fù)合物中ceo2的晶體形貌對rgo-ceo2傳感器的性能有重要影響。其中,六邊形的ceo2納米晶體催化性能最佳,達(dá)到了最高的靈敏度(1676.06ma/(cm2?mol/l)),較寬的線性范圍(18.0nmol/l到5.6μmol/l)及低的檢測限(9.6nmol/l)。這一最優(yōu)性能主要歸功于特殊形貌的ceo2良好的催化性能及rgo優(yōu)良的導(dǎo)電性和高的比表面積。本工作展示了一個通用的方法通過有效調(diào)控復(fù)合物中單組分的優(yōu)勢來合成具有超強(qiáng)協(xié)同作用的傳感平臺,同時也為快速實時檢測活細(xì)胞釋放no提供了極大的可能性。2.o2?-是細(xì)胞釋放的一種ros小分子,正常情況下對細(xì)胞的多種生命活動起著重要的介導(dǎo)作用,但是當(dāng)其含量超過正常水平時,會打破體內(nèi)氧化還原平衡,導(dǎo)致氧化應(yīng)激,進(jìn)而損壞細(xì)胞、引發(fā)病變,因此,實時定量檢測細(xì)胞釋放的o2?-對于疾病的診斷及預(yù)防非常重要。本工作中,采用dna誘導(dǎo)合成的磷酸錳梭狀材料(dna@mn3(po4)2)作為o2?-生物模擬酶功能化修飾氧化石墨烯(go)。該材料制備的特異性生物模擬酶傳感器表現(xiàn)出較高的靈敏度(1556.97ma/(cm2?mol/l))、較寬的檢測范圍(6.5nmol/l到8.85μmol/l)和極低的檢測限(2.1nmol/l)。此外,dna@mn3(po4)2/go傳感器實現(xiàn)了原位實時檢測藥物刺激下人類皮膚癌細(xì)胞和正常細(xì)胞釋放的o2?-,表現(xiàn)出良好的實時定量檢測性能。由實驗結(jié)果可得,癌細(xì)胞釋放的o2?-量為正常細(xì)胞的5倍(平均值)。3.原位實時檢測ros對于研究各種基礎(chǔ)的細(xì)胞生理過程極其重要,但是目前報道的工作大多檢測的是生長在培養(yǎng)基中細(xì)胞釋放的ros,其半衰期短、濃度低、活性高,造成測試的靈敏度和選擇性都受到極大的限制。本工作中,我們提出了一種新的方法將活細(xì)胞直接生長在dna/mn3(po4)2修飾的垂直生長碳納米管(vacnt)陣列上來構(gòu)建柔性支撐雜化膜,其中dna/mn3(po4)作為一種高效的o2仿生歧化酶,表現(xiàn)出很高的電催化活性;vacnt具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和生物相容性,提供了快速電子轉(zhuǎn)移載體和細(xì)胞生長平臺,此外細(xì)胞直接生長在傳感膜表面大大縮短了檢測底物與活性位點之間的擴(kuò)散距離,從而實現(xiàn)了高靈敏實時檢測癌細(xì)胞在藥物刺激下釋放的O2?-。與檢測培養(yǎng)基中細(xì)胞釋放O2?-相比,檢測靈敏度增加了6倍多,證明活細(xì)胞分泌的O2?-沒有經(jīng)過擴(kuò)散過程或經(jīng)過很短的擴(kuò)散距離,直接被生物膜捕獲并催化。這一設(shè)計縮短了細(xì)胞釋放的檢測目標(biāo)物與傳感器之間的距離,避免了在此擴(kuò)散過程中,大部分目標(biāo)物由于活性高、壽命短而衰減的可能性,大大提高了傳感器的靈敏度。4.眾所周知,細(xì)胞在生物體內(nèi)的實時生長環(huán)境是三維(3D)的,為了研究人類的生理活動機(jī)理,我們必須在體外培養(yǎng)細(xì)胞,要想得到更準(zhǔn)確的研究數(shù)據(jù),創(chuàng)造體外3D細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境極其重要。然而,現(xiàn)在報道的大部分工作均是基于2D平臺。本工作中,我們創(chuàng)造了一個3D細(xì)胞貼附/生長環(huán)境,首先通過化學(xué)氣相沉積法制備3D泡沫石墨烯(GF),然后采用綠色、簡易的基底增強(qiáng)-化學(xué)沉積法在GF上修飾Pt納米顆粒。該P(yáng)t@GF復(fù)合物表現(xiàn)出良好的多功能性,其中3D大孔GF表現(xiàn)出了擬人體實時生物環(huán)境,為細(xì)胞的生長提供了良好的貼附/生長支架以利于后續(xù)細(xì)胞釋放O2?-的高靈敏實時檢測,此外,Pt納米顆粒對O2?-表現(xiàn)出了超強(qiáng)的電催化活性。熒光顯微鏡和掃描電子顯微鏡的觀察結(jié)果表明,細(xì)胞在3D Pt@GF復(fù)合物上的生長狀態(tài)、表達(dá)、貼附及代謝活動相較其在2D Pt@石墨烯片(Pt@GS)復(fù)合物上,均表現(xiàn)出更優(yōu)的性能。與生長在2D Pt@GS上的細(xì)胞相比,本文提出的3D裝置檢測細(xì)胞釋放O2?-靈敏度提高了1.4倍,這可能歸功于電子可以在O2?-和GCE表面直接沿著石墨烯骨架傳遞、遷移,形成一條電子傳遞捷徑,極大地加快了電子轉(zhuǎn)移速率。然而,對于GS來說,電子在其間的傳遞必須經(jīng)過較長距離到達(dá)石墨烯層的缺陷邊緣穿過石墨烯層到達(dá)GCE表面。因此,3D Pt@GF復(fù)合物更有希望應(yīng)用于活細(xì)胞相關(guān)的研究,如藥物遞送、組織工程學(xué)及再生醫(yī)學(xué)等。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q26;O657.1
【部分圖文】：

細(xì)胞內(nèi)NO分子的生理活動

細(xì)胞內(nèi)ROS的生成和活動情況[16]

圖 1.3 細(xì)胞內(nèi) ROS 濃度失衡時，對細(xì)胞的損傷示意圖[16]。況下，如外傷性腦損傷、局部缺血-再灌注及缺氧等，O2 22]。據(jù)報道，O2 參與到一系列衰老、癌癥及帕金森病

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5 趙W

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