利用重組大腸桿菌和核糖開關(guān)進行L-賴氨酸生產(chǎn)的研究

發(fā)布時間：2020-09-07 10:09

　　 L-賴氨酸(L-lysine, HO2CCH(NH2)(CH2)4NH2)是一種α-氨基酸,作為人體必需的氨基酸之一,與L-精氨酸和L-組氨酸一樣,屬于堿性氨基酸,能促進人體發(fā)育、增強免疫功能并提高中樞神經(jīng)組織的功能。在動物飼料中添加L-賴氨酸可以明顯改善飼料中氨基酸的營養(yǎng)吸收平衡,促進家畜的健康快速成長。然而由于L-賴氨酸在谷物食品中含量甚低,且在加工過程中易被破壞而導致缺乏,故被稱為第一限制性氨基酸。作為一種在食品,醫(yī)藥以及化妝品等行業(yè)被廣泛使用的添加劑,雖然L-賴氨酸年產(chǎn)量在以非�？斓乃俣仍鲩L,但是其需求量也在逐年快速增長,例如2011年,全球L-賴氨酸的產(chǎn)量達到1,650,000噸,而2012年僅用于食品添加劑中的L-賴氨酸產(chǎn)量就超過了1,570,000噸。L-賴氨酸的生產(chǎn)最早主要是依靠化學合成法和蛋白質(zhì)水解法,但是這些方法存在原料來源有限或者成本較高、生產(chǎn)周期較長、工藝復雜以及環(huán)境污染大等缺點,因而逐漸被現(xiàn)代L-賴氨酸產(chǎn)業(yè)所淘汰。而生產(chǎn)原材料來源廣泛且成本較低、周期較短、工藝易于擴大、環(huán)境污染小的微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-賴氨酸日益得到更加廣泛的應(yīng)用。微生物直接發(fā)酵法的最常用原料為制糖工業(yè)的廢糖蜜、淀粉水解液等非常廉價的糖質(zhì)原料或者醋酸、乙醇等。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-賴氨酸的主要微生物有谷氨酸棒狀桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、黃色短桿菌以及大腸桿菌等。這些發(fā)酵菌株主要通過上世紀50年代后期廣泛采用的微生物誘變育種以及抗阻遏反饋抑制等技術(shù)篩選和選育的。上世紀70年代以來,隨著育種技術(shù)的進一步發(fā)展,一些具有多重遺傳性狀的突變菌株被選育出來,使發(fā)酵工藝逐漸地成熟和完善,L-賴氨酸的產(chǎn)量也得到快速地增長。然而隨著近幾十年來發(fā)酵工業(yè)的不斷進步,通過傳統(tǒng)遺傳操作改造所獲得的突變菌株,由于遺傳背景不清晰,多年傳代培養(yǎng)及發(fā)酵過程中的非定向進化等原因,造成發(fā)酵菌株優(yōu)秀遺傳性狀的傳遞難于控制,菌種的選育和保藏困難,L-賴氨酸產(chǎn)量產(chǎn)率難以保持穩(wěn)定。由于L-賴氨酸的合成需要多種前體物,生物合成途徑中的調(diào)控機制比較復雜,傳統(tǒng)的遺傳操作及育種技術(shù)很難進一步提高L-賴氨酸的產(chǎn)量。而且經(jīng)過數(shù)十年的技術(shù)積累,目前成熟的L-賴氨酸發(fā)酵菌株及其合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶和基因的序列等都已被歐美日韓等國家申請專利,進一步限制了L-賴氨酸工業(yè)的發(fā)展。近些年隨著代謝工程、比較基因組學、轉(zhuǎn)錄組學以及合成生物學的發(fā)展,人們對微生物關(guān)鍵代謝物的合成途徑及其調(diào)控機制的研究得到進一步地深入,通過相關(guān)內(nèi)源基因的過量表達以及外源基因的引入,競爭分支代謝途徑的減弱或者消除,轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的引入以及高通量的定向進化篩選等技術(shù)手段,各種合成特定目標化合物的微生物工程菌株被廣泛地應(yīng)用于各種氨基酸、有機酸、生物燃料、萜類化合物以及聚羥基脂肪酸等現(xiàn)代微生物發(fā)酵工業(yè)中。目前,雖然谷氨酸棒狀桿菌在各類發(fā)酵中占據(jù)主要地位,但是由于大腸桿菌具有遺傳背景清晰,遺傳操作技術(shù)簡便成熟,易于培養(yǎng),生長周期短等優(yōu)點而越來越多地被代謝工程改造并被用于許多有經(jīng)濟價值的化合物的發(fā)酵生產(chǎn)中。針對L-賴氨酸生物合成途徑中的諸多限制性因素,本論文首先利用了代謝工程中常用的基因敲除、過表達相關(guān)基因、定點突變關(guān)鍵基因以及引入外源基因等技術(shù),對野生型大腸桿菌K-12 MG1655進行了代謝工程改造。通過敲除編碼L-賴氨酸脫羧酶的cadA和ldcC基因,解除了其對細胞內(nèi)過量積累的L-賴氨酸的降解；敲除了編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的pgi基因,從而增加了流向L-賴氨酸合成途徑中所需的NADPH:敲除了編碼葡萄糖依賴的磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(PTS)中的ptsG基因,從而減少了細胞內(nèi)磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的消耗,為L-賴氨酸的生物合成提供更多的前體；敲除三羧酸循環(huán)途徑(TCA)中的編碼琥珀酰輔酶A合酶的sucC/D基因,從而將TCA循環(huán)與L-賴氨酸的生物合成途徑相偶聯(lián),為后者提供更多了琥珀酰輔酶A；為了進一步提高L-賴氨酸的產(chǎn)量,在低拷貝表達質(zhì)粒pCL1920上表達了來自于野生型大腸桿菌K-12 MG1655通過定點突變解除了末端產(chǎn)物L-賴氨酸反饋抑制的編碼天冬氨酸激酶的lysCfbr基因、編碼二氫吡啶甲酸合酶的dapAfbr基因,以及二氨基庚二酸脫羧酶的lysA基因和來源于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的編碼二氨基庚二酸脫氫酶的ddh基因,構(gòu)建了質(zhì)粒pCLIV,并且轉(zhuǎn)入重組大腸桿菌中構(gòu)建了L-賴氨酸的基礎(chǔ)生產(chǎn)菌株WML001。搖瓶發(fā)酵顯示該菌株的L-賴氨酸產(chǎn)量可以達到3.89g/L,為進一步的改造提供了基礎(chǔ)。作為一門新興的科學,合成生物學通過分子生物學、基因組學、信息技術(shù)和工程學各學科的交叉融合而產(chǎn)生一系列新的工具和方法。通過自然與合成元件的不同組合,來設(shè)計、改良、研發(fā)甚至制造各種具有特殊功能的生物體。雖然合成生物學與轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在著一定的交叉,但它是進一步地發(fā)展和改善,能夠更加高效,便捷地完成傳統(tǒng)遺傳技術(shù)難以完成的任務(wù)。核糖開關(guān)做為一類位于mRNA5'端非翻譯區(qū)的順式作用元件,具有一個配體結(jié)合區(qū)域,通過專一地與細胞內(nèi)某些特定的化合物相結(jié)合而發(fā)生構(gòu)象的變化,進而影響與之相鄰基因的表達,是目前合成生物學中應(yīng)用非常廣泛的一類遺傳元件。L-賴氨酸核糖開關(guān)是位于大腸桿菌lysC基因5'端上游的一段非翻譯序列,當體內(nèi)L-賴氨酸的濃度較高時,抑制下游基因序列的表達,是一種“抑制型”的核糖開關(guān)。將該序列與編碼四環(huán)素抗性基因以及Ni2+通道蛋白的雙重篩選標記tetA基因一同克隆至高拷貝表達載體pUCl 9上,構(gòu)建L-賴氨酸核糖開關(guān)篩選元件。當將該元件轉(zhuǎn)入重組大腸桿菌中,如果宿主菌L-賴氨酸的產(chǎn)量較高,則會通過核糖開關(guān)抑制下游tetA基因的表達,減少細胞對Ni2+的攝入,從而可使宿主菌在一定濃度有毒鹽離子(Ni2+)的存在下,獲得較高的生長速率,而L-賴氨酸產(chǎn)量較低的菌株,則由于tetA基因的表達受到的抑制作用較弱而攝入較多的Ni2+,從而生長速率較慢。本論文通過上述代謝工程技術(shù),得到了L-賴氨酸的基礎(chǔ)生產(chǎn)菌株WML001,但是其中起關(guān)鍵作用的天冬氨酸激酶lysCfbr等基因卻受到了日本味之素等公司的專利保護,這限制了該菌株在未來的工業(yè)化應(yīng)用,因此本論文根據(jù)以前的研究成果采用了未見諸專利的來源于枯草芽孢桿菌天冬氨酸激酶Ⅱ的N末端區(qū)域和來自于棲熱胞菌天冬氨酸激酶C末端區(qū)域的融合酶BT作為該酶的替代。但是將該酶直接應(yīng)用于L-賴氨酸搖瓶發(fā)酵的時候,卻發(fā)現(xiàn)在重組大腸桿菌的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)物中幾乎檢測不到L-賴氨酸。為此,本論文對酶進行了全序列的隨機突變,并且利用了L-賴氨酸核糖開關(guān)做為工具,最終篩選富集到了三個突變BT酶。與目前發(fā)酵工業(yè)上廣泛采用的來自于大腸桿菌的天冬氨酸激酶lysCfbr基因的相比,這三個突變酶的宿主菌在相同的篩選條件下均表現(xiàn)出了更優(yōu)異的生長速率。經(jīng)過三輪的富集篩選過程后,這三個突變酶的宿主菌分別占到了各自培養(yǎng)物菌群比例的72.5%,62.5%以及71.4%,證明L-賴氨酸核糖開關(guān)確實可以富集高產(chǎn)L-賴氨酸的有益突變菌；通過將編碼這三個突變BT酶的基因(bt1,bt2和bt3),野生型bt,以及天冬氨酸激酶Ⅲ的基因lysCfbr序列克隆至表達載體pET28a中,在大腸桿菌BL21中進行原核表達,發(fā)現(xiàn)這幾種酶在全細胞SDS凝膠電泳檢測中,占可溶性蛋白表達總量的30%左右。在進行酶活檢測時,這三個突變酶的酶活分別提高了77%,149%和160%,達到甚至超過了商業(yè)生產(chǎn)上廣泛使用的lysCfbr基因所編碼的天冬氨酸激酶的酶活；而當將這些基因克隆至低拷貝表達質(zhì)粒pCL1920中,并轉(zhuǎn)入已經(jīng)在基因組上對dapA(編碼二氫吡啶甲酸合酶)進行了解除反饋抑制定點突變的重組大腸桿菌中進行“互補”搖瓶發(fā)酵實驗檢測時,表達這三個突變酶的重組大腸桿菌的L-賴氨酸產(chǎn)量達到甚至超過了商業(yè)生產(chǎn)上廣泛使用的lysCfbr基因所編碼的天冬氨酸激酶。這些結(jié)果證明了L-賴氨酸核糖開關(guān)可以做為一種簡單高效的篩選工具,對L-賴氨酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶進行定向進化后的篩選,而無需復雜繁瑣的檢測方法和昂貴的實驗儀器。該方法同樣也可以對該途徑中的其他關(guān)鍵酶,例如二氫吡啶甲酸合酶,進行定向進化后的篩選。本論文首先通過構(gòu)建L-賴氨酸的基礎(chǔ)生產(chǎn)菌株WML001,對L-賴氨酸生物合成途徑中的限制性因素進行了研究；以產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用為前提,首次將核糖開關(guān)這一合成生物學元件引入L-賴氨酸合成途徑中關(guān)鍵酶的定向進化后篩選,取得了預期的實驗結(jié)果。本論文的工作為L-賴氨酸工業(yè)化生產(chǎn)的進一步發(fā)展提供了重要的研究基礎(chǔ)。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：Q93;TQ922
【部分圖文】：

示意圖,質(zhì)粒,單克隆,菌落

山東大學博壬學位論文逡逑時至長出清晰的單克隆菌落；逡逑取單克隆菌落劃線于新鮮的１００邋＾ｉｇ／ｍＬ的壯觀霉素的ＬＢ。直溫倒置培養(yǎng)１０到１２小時至長出清晰的單克隆菌落；勒，進行菌落ＰＣＲ檢測，對檢測大小正確的單克隆進行測序）測序正確的質(zhì)粒ＰＣＬ１９２０－如沁護少加Ａ－如＾即命名為ｐ

標準曲線,賴氨酸,標準曲線

線性檢測范圍約為０．５－５％，從而可Ｗ將發(fā)酵產(chǎn)物直接用于檢測，無需稀釋。逡逑�。担纾�、ｌＯｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４５￡／１＾的以賴氨酸標準溶液，按上述方逡逑法于ＯＤ４７０邋ｎｍ處測定吸光度，并且繪制以賴氨酸檢測的標準曲線，如圖２－４逡逑所示，吸光度與以賴氨酸濃度在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性關(guān)系，得到的公式為逡逑ｙ＝２１６．７７ｘ＋３．１６，民２達到０．９９９，可＾文用于一定條件下的發(fā)酵液中的以賴氨酸的逡逑檢測；但是該方法所檢測到的以賴氨酸產(chǎn)量偏高，原因可能是由于發(fā)酵樣品含逡逑有以賴氨酸的結(jié)構(gòu)類似物等，并且由于所需的心賴氨酸濃度較高，對基本菌株逡逑生產(chǎn)以賴氨酸的檢測誤差較大。逡逑５０邋－１逡逑ｙ邋＝邋２１６．７７ｘ邋＋邋３ＪＬ＾逡逑４０邋－邐＝逡逑恮邋３０邋－逡逑ｔ邋２。－逡逑３邋１。／逡逑０邋Ｈ邐１邐１邐！邐！邐１逡逑０邐０．０５邐０．１邐０．巧邐０．２邐０．２５逡逑ＯＤ４７０邋ｎｍ逡逑圖２－４心賴氨酸標準曲線逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－４邋Ｓｌ；ａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ逡逑２．３N２柱前衍生法逡逑由于酸性印王酬法測定以賴氨酸的產(chǎn)量數(shù)值偏大，并且所需要的以賴氨酸逡逑濃度較高，因此柱前衍生法也逐漸成為測定氨基酸的一種方法，尤其適合所構(gòu)建逡逑的起始產(chǎn)量較低的以賴氨酸基本生產(chǎn)菌株的檢測。該方法測量的氨基酸最大濃逡逑度約為４邋ｇ／Ｌ，若待檢測樣品中的氨基酸濃度較高時，應(yīng)該適當稀釋后使用。雖逡逑然該方法檢測的靈敏度較高

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