【摘要】：研究背景骨腫瘤是一種發(fā)生于骨組織或者其附屬組織的一種常見病,研究發(fā)現(xiàn)至少50%的癌癥晚期患者會出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞在骨組織中形成骨轉(zhuǎn)移時(shí),會對骨質(zhì)造成破壞。骨的破壞會產(chǎn)生骨相關(guān)事件(SREs),包括病理性骨折、高鈣血癥、骨髓功能的下降等。這些并發(fā)癥影響了對腫瘤的治療,增加了患者的疼痛,降低了患者的存活率。由于骨質(zhì)硬度大、血管分布少、藥物滲透性低等特點(diǎn),按傳統(tǒng)給藥方式很難將藥物有效遞送至骨轉(zhuǎn)移瘤處。如何有效遞送藥物,是解決骨轉(zhuǎn)移瘤治療難題的關(guān)鍵。雙膦酸鹽類(BPs)對骨的羥基磷灰石(HA)具有很高的親和力。一旦BPs進(jìn)入體內(nèi)后,BPs就會被快速從血液循環(huán)中清除而吸附到暴露的骨礦物質(zhì)區(qū)域。阿侖膦酸鈉(ALN)屬于第三代BPs類藥物,具有很強(qiáng)的親骨性,其結(jié)構(gòu)簡單,可化學(xué)修飾,被廣泛用作遞藥系統(tǒng)中的骨靶向配體。研究表明,對環(huán)境響應(yīng)的遞藥系統(tǒng)對藥物的可控釋放起到關(guān)鍵作用。腙鍵是一種對p H敏感的化學(xué)鍵,在血液循環(huán)(p H=7.4)中穩(wěn)定,在腫瘤細(xì)胞溶酶體(p H6)中會發(fā)生斷裂。通過腙鍵將嵌段共聚物連接可制備出對p H敏感的遞藥系統(tǒng)。二硫鍵是一種對谷胱甘肽(GSH)敏感的化學(xué)鍵,腫瘤細(xì)胞內(nèi)外GSH的含量差別巨大。腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH的濃度可達(dá)到2-10 m M,而腫瘤細(xì)胞外GSH的濃度約為2-20μM,濃度幾乎相差1000倍。利用二硫鍵連接的遞藥系統(tǒng)可以選擇性的將藥物釋放在GSH含量高的腫瘤細(xì)胞內(nèi),而在血液中可以穩(wěn)定存在。聚乙二醇(PEG)是一種水溶性、生物相容性良好且無免疫原性的非離子聚合物,在藥物遞送系統(tǒng)研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。利用PEG上的可修飾基團(tuán),將其作為靶向配體分子與藥物(或者藥物載體)之間的橋連臂,可構(gòu)建主動靶向藥物載體。多糖是一類天然來源的可生物降解的聚合物材料,多糖骨架上的功能基團(tuán),尤其是羥基,具有顯著增溶作用。目的:本研究以阿侖膦酸鈉為骨靶向配體,以阿霉素(DOX)為模型藥物,分別制備基于聚乙二醇(PEG)的p H敏感膠束和基于葡聚糖(DEX)的氧化還原敏感膠束。觀察其體內(nèi)外抗腫瘤活性及骨靶向性,為骨轉(zhuǎn)移瘤的靶向治療探索新的技術(shù)手段。方法:1.分別制備了p H敏感膠束DOX-hyd-PEG-ALN和氧化還原敏感膠束OA-DEX(5K)-ALN、MA-DEX(5K)-ALN、ODA-DEX(5K)-ALN、DSPE-DEX(5K)-ALN、DSPE-DEX(20K)-ALN、DSPE-DEX(70K)-ALN、DSPE-DEX(150K)-ALN。2.通過改變蒸餾水用量、溫度、投藥量等篩選出載藥膠束的最優(yōu)制備工藝。3.通過測定載藥量、包封率、粒徑、Zeta電位、穩(wěn)定性等對膠束進(jìn)行表征。4.測定載藥膠束在不同介質(zhì)溶液中的釋藥特性。5.測定載藥膠束對HA的吸附性。6.通過MTT法測定載藥膠束的細(xì)胞毒性;利用熒光顯微鏡以及流式細(xì)胞術(shù)觀察腫瘤細(xì)胞對載藥膠束的攝取;通過激光共聚焦觀察載藥膠束轉(zhuǎn)運(yùn)DOX在腫瘤細(xì)胞中的分布;選用Caspase-3試劑盒測定載藥膠束對腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用;采用流式細(xì)胞術(shù)觀察載藥膠束對腫瘤細(xì)胞周期的影響。7.采用直接注射法制備肺癌骨轉(zhuǎn)移瘤模型;通過Micro-CT技術(shù)觀察骨轉(zhuǎn)移瘤對骨的影響;利用活體成像儀和熒光顯微鏡等手段測定載藥膠束給藥后DOX在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布;通過測定裸鼠腫瘤體積以及生存率等評價(jià)載藥膠束的體內(nèi)抗腫瘤活性;通過組織HE染色法觀察載藥膠束的毒副作用。結(jié)果:一、基于PEG的p H敏感膠束DOX-hyd-PEG-ALN1.通過1H NMR和IR等方法證實(shí)合成的DOX-hyd-PEG-ALN為目標(biāo)物聚合物材料。2.采用透析法制備DOX@DOX-hyd-PEG-ALN,制備溫度為60oC,制備用水量為32 m L,DOX-hyd-PEG-ALN與DOX的投料比為10:2。最終制得的DOX@DOX-hyd-PEG-ALN粒徑為114 nm,載藥量為24.3%,包封率為64.3%,CMC為2.3 mg/L。TEM觀察顯示DOX@DOX-hyd-PEG-ALN為球形,XPS分析表明骨靶向配體ALN存在于膠束表面。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN體外釋藥具有明顯的p H依賴性。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN對HA呈現(xiàn)迅速吸附的特性。3.MTT結(jié)果顯示在48 h后,DOX@DOX-hyd-PEG-ALN的細(xì)胞毒性明顯強(qiáng)于DOX。熒光顯微鏡以及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,腫瘤細(xì)胞對DOX@DOX-hyd-PEG-ALN的攝取具有時(shí)間依賴性。激光共聚焦結(jié)果表明游離DOX與腫瘤細(xì)胞孵育后能迅速分布于細(xì)胞核內(nèi),而DOX@DOX-hyd-PEG-ALN轉(zhuǎn)運(yùn)DOX首先分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),隨著DOX@DOX-hyd-PEG-ALN破壞,釋放出DOX,然后分布在細(xì)胞核內(nèi)。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用具有時(shí)間和濃度依賴性。DOX以及DOX@DOX-hyd-PEG-ALN能夠時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生G2期和S期阻滯。4.Micro-CT結(jié)果顯示腫瘤生長處骨質(zhì)被破壞,可見溶骨性區(qū)域。腫瘤切面目測呈魚肉狀,部分腫瘤細(xì)胞突破骨質(zhì)生長。HE組織染色結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞核仁清楚且大,細(xì)胞呈不規(guī)則狀排列。5.活體成像儀和熒光顯微鏡結(jié)果顯示,與DOX相比,DOX@DOX-hyd-PEG-ALN展現(xiàn)出良好的骨靶向性以及對腫瘤組織更強(qiáng)的滲透性,同時(shí)DOX@DOX-hyd-PEG-ALN降低了DOX在心臟組織的分布。體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于DOX治療組,DOX@DOX-hyd-PEG-ALN治療組裸鼠的生存期得到了顯著延長,腫瘤生長得到了明顯抑制。Micro-CT結(jié)果顯示,相比于DOX,DOX@DOX-hyd-PEG-ALN能夠提高骨腫瘤處的平均骨質(zhì)密度。HE組織染色結(jié)果說明DOX@DOX-hyd-PEG-ALN對荷瘤裸鼠主要臟器沒有毒副作用,但對腫瘤組織具有明顯的殺傷作用,腫瘤細(xì)胞排列疏散,腫瘤組織出現(xiàn)大片空洞。二、基于DEX的氧化還原敏感膠束1.通過1H NMR和IR等方法證實(shí)合成的OA-DEX(5K)-ALN、MA-DEX(5K)-ALN、ODA-DEX(5K)-ALN、DSPE-DEX(5K)-ALN、DSPE-DEX(20K)-ALN、DSPE-DEX(70K)-ALN、DSPE-DEX(150K)-ALN為目標(biāo)聚合物材料。2.采用透析法制備載藥膠束,制備溫度為60oC,制備用水量為32 m L,材料藥物投料比為10:3。其中DOX@OA-DEX(5K)-ALN、DOX@MA-DEX(5K)-ALN、DOX@ODA-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN的粒徑約為60 nm,而DOX@DSPE-DEX(70K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(150K)-ALN粒徑約為90 nm。7種載藥膠束的Zeta電位處于-18到-25 m V之間。膠束載藥量均高于17%,包封率均高于70%。膠束穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示OA-DEX(5K)-ALN、MA-DEX(5K)-ALN、DSPE-DEX(5K)-ALN以及DSPE-DEX(20K)-ALN在含有20%FBS的PBS溶液中可以穩(wěn)定存在5天以上;而DSPE-DEX(70K)-ALN、DSPE-DEX(150K)-ALN和ODA-DEX(5K)-ALN在相同條件下穩(wěn)定性較差,隨著孵育時(shí)間延長,其粒徑表現(xiàn)出明顯增大的趨勢。TEM結(jié)果顯示DOX@OA-DEX(5K)-ALN、DOX@MA-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN的外觀接近球形;XPS分析表明骨靶向配體ALN存在于膠束的表面。體外釋藥研究表明,膠束釋藥具有GSH濃度依賴性。HA吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)過ALN修飾的膠束中,70%以上DOX與HA發(fā)生了吸附。3.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DOX@OA-DEX(5K)-ALN、DOX@MA-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN對A549細(xì)胞、PC-3細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞以及MDA-MB-231/ADR細(xì)胞的毒性作用均明顯大于DOX,其中DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN對A549細(xì)胞、PC-3細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的毒性強(qiáng)于DOX@OA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(5K)-ALN,且對A549細(xì)胞的毒性作最強(qiáng)。熒光顯微鏡以及流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,A549細(xì)胞對DOX@MA-DEX(5K)-ALN與DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN的攝取具有時(shí)間依賴性。相比于DOX,DOX@MA-DEX(5K)-ALN與DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN可以很好的將DOX遞送至耐DOX乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231/ADR)內(nèi)。激光共聚焦結(jié)果表明DOX能迅速的分布于A549細(xì)胞核內(nèi),但并不能有效進(jìn)入MDA-MB-231/ADR細(xì)胞內(nèi)。DOX@MA-DEX(5K)-ALN與DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN均可將DOX轉(zhuǎn)運(yùn)至A549以及耐DOX的MDA-MB-231/ADR細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。DOX@MA-DEX(5K)-ALN與DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN誘導(dǎo)A549細(xì)胞和MDA-MB-231/ADR細(xì)胞凋亡的作用均具有時(shí)間和濃度依賴性,且凋亡誘導(dǎo)作用強(qiáng)于DOX。與DOX相比,DOX@MA-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯的作用更強(qiáng)。5.活體成像儀和熒光顯微鏡結(jié)果顯示,與DOX相比,DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN展現(xiàn)出了良好的骨靶向性以及腫瘤組織蓄積性,同時(shí)載藥膠束降低了DOX在心臟組織的分布。體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于DOX治療組,DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN治療組裸鼠的生存期得到了顯著延長,腫瘤生長得到了明顯抑制。DOX@MA-DEX(5K)-ALN對荷瘤裸鼠的體重?zé)o明顯影響,治療效果優(yōu)于DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN。Micro-CT結(jié)果顯示,相比于DOX,DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN能夠明顯提高骨腫瘤處的平均骨質(zhì)密度。HE組織染色結(jié)果顯示DOX@MA-DEX(5K)-ALN對荷瘤裸鼠主要臟器沒有毒副作用,對腫瘤組織具有明顯的殺傷作用。結(jié)論:一、DOX@DOX-hyd-PEG-ALN具有較高的載藥量以及包封率。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN可以有效的被腫瘤細(xì)胞攝取,具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN可使DOX更多的蓄積在骨轉(zhuǎn)移瘤處,增強(qiáng)了DOX的抗腫瘤活性,延長了荷瘤裸鼠的生存時(shí)間,減輕了腫瘤細(xì)胞對骨的破壞作用,并降低了DOX的毒副作用。二、基于DEX的載藥膠束粒徑均小于100 nm。DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN可以有效的被腫瘤細(xì)胞以及耐藥腫瘤細(xì)胞攝取;其比DOX具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN具有很強(qiáng)的骨靶向性,增強(qiáng)了DOX對腫瘤的殺傷作用,延長了荷瘤裸鼠的生存時(shí)間,減弱腫瘤對骨的侵襲以及對骨密度的降低作用,降低了DOX的毒副作用�？v向比較DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DOX-hyd-PEG-ALN對荷瘤裸鼠的治療作用,結(jié)果顯示DOX@MA-DEX(5K)-ALN可以將更多的DOX遞送至腫瘤組織內(nèi),具有更好的抗腫瘤活性。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R943;R965
【圖文】：

圖 1 骨轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生機(jī)制，腫瘤細(xì)胞與骨質(zhì)微環(huán)境的相互作用機(jī)理圖[14]。前治療骨轉(zhuǎn)移癌的策略由于大多數(shù)骨轉(zhuǎn)移癌患者屬于癌癥晚期患者，在治療中主要采取姑息、對原則。目前治療骨轉(zhuǎn)移癌的方法有放射治療，手術(shù)治療和化療。 放射治療放射治療骨轉(zhuǎn)移癌是指通過靜脈注射，將放射性物質(zhì)注入體內(nèi)，使高度選射性核素濃聚在骨組織，利用該核素不斷發(fā)射的 β 射線對轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行照射腫瘤作用[19]。高劑量輻射可有效達(dá)到抗腫瘤作用，從而減輕癌性骨痛；低射可以有效抑制引起疼痛的化學(xué)物質(zhì)的分泌，進(jìn)而抑制腫瘤生長，減輕骨 手術(shù)治療術(shù)治療將腫瘤直接切除，在減輕患者骨痛的同時(shí)可以恢復(fù)器官的正常功能早知道轉(zhuǎn)移瘤產(chǎn)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)施手術(shù)治療，是比較安全有效的治療策 化療

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文多糖骨架上大量的功能基團(tuán)被疏水鏈修飾后引發(fā)自組裝而形成膠束。值得注意的是一些研究者發(fā)現(xiàn)，膽固醇改性支鏈淀粉多糖自組裝過程中形成了多區(qū)域的疏水微而不是單一的疏水內(nèi)核[72]。這些微區(qū)以物理交聯(lián)的方式存在于親水外殼之內(nèi)，因以這種方式形成的自組裝結(jié)構(gòu)可以被認(rèn)為是納米凝膠[73, 74]。疏水核（單室對多室的性質(zhì)取決于兩親多糖的濃度[75]，疏水基團(tuán)的性質(zhì)以及多糖主鏈的取代程度[76, 77]。

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文04 mmol）的 EDCI，90 mg（0.02 mmol）的 DOX-hyd-PEG-COOH 和 20 在 15 mL 二氧六環(huán)溶液中室溫避光反應(yīng) 8 h；②12 mg（0.04 mmol）ALN 15 mL H2O，然后加入到上述反應(yīng)液中。在反應(yīng)過程中，緩慢滴加 0.2 M 應(yīng)液的 pH 值穩(wěn)定維持在 7.0 左右。2 小時(shí)后繼續(xù)滴加 0.2 M NaOH 使 pH繼續(xù)反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后透析，凍干后得 DOX-hyd-PEG-ALN 聚合物。-hyd-PEG 聚合物作為對照，用 CH3O-PEG-COOH 代替 HOOC-PEG-COO 和1H NMR 對合成的目標(biāo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

本文編號：2770723