本文關(guān)鍵詞：快速檢測(cè)土壤中酞酸酯的免疫分析技術(shù)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：酞酸酯(PAEs)又名鄰苯二甲酸酯,作為增塑劑被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和塑料制品中,具有持久性有機(jī)污染物(POPs)的特性,廣泛存在于大氣、水、土壤和生物等環(huán)境中。PAEs是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生類雌激素作用,阻止與動(dòng)物生殖和發(fā)育有關(guān)的激素的合成、分泌、貯存、運(yùn)輸、結(jié)合和清除等過(guò)程,干擾血液維持正常的激素水平,具有致癌性、致畸性和致突變性。1977年,美國(guó)環(huán)保署(USEPA)將6種PAEs類化合物列入重點(diǎn)控制污染物名單,包括鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DnOP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP);20世紀(jì)80年代,我國(guó)也將DMP、DBP、DnOP列入環(huán)境優(yōu)先污染物黑名單。我國(guó)是設(shè)施農(nóng)業(yè)種植面積最大的國(guó)家,設(shè)施模式以塑料大棚和地膜覆蓋為主。PAEs能夠從農(nóng)膜中釋放進(jìn)入土壤,加之破碎和廢棄的農(nóng)膜能夠在土壤中長(zhǎng)期存在,不僅破壞土壤結(jié)構(gòu)、退化土壤功能,還會(huì)通過(guò)作物吸收影響農(nóng)產(chǎn)品安全,危害人體健康。因此,準(zhǔn)確測(cè)定土壤中PAEs的含量,對(duì)于保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境、保證農(nóng)產(chǎn)品安全和保護(hù)人體健康都具有十分重要的意義。PAEs的測(cè)定方法在早期主要有比色法、滴定法和分光光度法等,但這些方法的靈敏度低,選擇性差。目前,一些儀器分析技術(shù)被應(yīng)用于PAEs檢測(cè),主要包括氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)等。盡管儀器分析法的靈敏度和精密度高,但是它們存在樣品前處理復(fù)雜、操作繁瑣耗時(shí)、儀器昂貴和不能在線連續(xù)分析等問(wèn)題,迫切需要發(fā)展簡(jiǎn)便、快速、靈敏、可靠的檢測(cè)技術(shù)。近年來(lái),基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的免疫分析方法成為研究熱點(diǎn)。以固相載體吸附抗原-抗體為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫分析法(ELISA),不需要昂貴的儀器,具有特ii異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷等特點(diǎn),在現(xiàn)場(chǎng)篩選和大量樣本的快速檢測(cè)中顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì),已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、藥物篩選和環(huán)境分析與監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。針對(duì)paes的免疫檢測(cè),目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開展了一些研究工作,建立了時(shí)間分辨熒光免疫分析法、直接競(jìng)爭(zhēng)elisa法、競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫法和間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法,但是這些方法的線性范圍較窄、靈敏度較低,制備的抗體只能識(shí)別單一paes,難以滿足同時(shí)檢測(cè)環(huán)境中多種paes的實(shí)際需要。為此,本文以美國(guó)環(huán)保署優(yōu)先監(jiān)測(cè)的6種paes、增塑劑中常用的鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(dchp)和鄰苯二甲酸二壬酯(dnp)為檢測(cè)對(duì)象,基于paes類化合物的共性結(jié)構(gòu)特征,設(shè)計(jì)并合成了2種半抗原,制備免疫原和包被原,研制抗paes的特異性抗體,建立檢測(cè)paes的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析法(ic-elisa)和光纖免疫傳感技術(shù),并成功應(yīng)用于設(shè)施菜地土壤中paes的快速靈敏檢測(cè),取得了如下主要研究成果:1.以4-硝基鄰苯二甲酸為起始化合物,經(jīng)過(guò)酯化、還原和酰胺化等反應(yīng),成功合成了檢測(cè)paes的2種半抗原(i和ii),研制的人工抗原具有載體蛋白和半抗原的特征吸收峰,初步說(shuō)明偶聯(lián)成功。兩種免疫原(半抗原i-bsa和半抗原ii-bsa)中蛋白濃度分別為4.28和5.35mg·ml-1,包被原(半抗原i-ova和半抗原ii-ova)中蛋白濃度分別為2.78和2.05mg·ml-1。半抗原i、ii與bsa的結(jié)合比分別為11:1和8.5:1,與ova的結(jié)合比分別為6.5:1和4:1,通過(guò)薄層層析(tlc)、核磁共振氫譜(1hnmr)和質(zhì)譜表征,說(shuō)明人工全抗原的成功合成。2.用制備的人工抗原免疫新西蘭大白兔,獲得從a1和a2兔(以半抗原i-bsa為免疫原)產(chǎn)生的抗體效價(jià)分別為1:12800和1:25600,b1和b2兔(以半抗原ii-bsa為免疫原)產(chǎn)生的抗體效價(jià)分別為1:12800和1:12800�；赼2兔獲得的抗血清效價(jià)最高,進(jìn)一步純化該抗血清,獲得抗體中蛋白含量為2.959mg·ml-1。3.采用ic-elisa法,優(yōu)化并獲得paes的最佳檢測(cè)條件:包被原濃度和抗血清的稀釋倍數(shù)分別為0.5μg·ml-1和1:3200,磷酸鹽緩沖溶液(pbs)的ph和鹽濃度分別為7.4和0.01mol·l-1,酶標(biāo)二抗稀釋度為1:2000,抗原和一抗反應(yīng)60min,paes標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醇含量為10%。在最佳檢測(cè)條件下,以paes類化合物的濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),抑制結(jié)合率(b/b0)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線,獲得dmp、dep、dbp、dehp、dnop、bbp、dchp和dnp的檢出限分別為0.013、0.013、0.012、0.042、0.035、0.021、0.017和0.016μg·l-1,抗體與8種paes的交叉反應(yīng)率分別為100%、83.84%、76.84%、35.77%、39.22%、44.01%、16.69%和26.51%,表明該抗體具有較寬的識(shí)別范圍;對(duì)dmp的ic50為17.12μg·l-1,線性范圍為0.08~363.9μg·l-1。對(duì)空白土壤樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),在加標(biāo)水平為5、10和100μg·kg-1時(shí),獲得的平均回收率為63.9%~103.6%,rsd11.32%;gc-ms法的平均回收率為68.3%~101.4%,rsd10.39%,兩種方法取得了一致的結(jié)果。建立的ic-ELISA法拓展了PAEs檢測(cè)的線性范圍,檢出限明顯降低,簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟,測(cè)定時(shí)間僅需4.5 h,并成功應(yīng)用于設(shè)施菜地土壤中PAEs的檢測(cè)。4.構(gòu)建光纖倏逝波免疫傳感器,用Cy5.5 NHS酯標(biāo)記抗體,優(yōu)化并獲得PAEs的最佳檢測(cè)條件:包被原濃度為50μg·m L-1,PBS溶液的pH和鹽濃度分別為7.4和0.01 mol·L-1,PAEs-抗體預(yù)反應(yīng)時(shí)間為5 min。在最佳檢測(cè)條件下,以PAEs類化合物的濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),抑制結(jié)合率為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線,獲得DMP、DEP、DBP、DEHP、DnOP、BBP、DCHP和DNP的檢出限分別為0.147、0.153、0.148、0.342、0.337、0.285、0.317和0.156μg·L-1,抗體與8種PAEs的交叉反應(yīng)率分別為100%、71.94%、62.66%、31.14%、51.8%、42.85%、16.63%和22.75%;對(duì)DMP的IC50為9.54μg·L-1,線性范圍為0.22~145μg·L-1。傳感器具有良好的穩(wěn)定性和再生性能,使用相同濃度的標(biāo)記抗體,探頭進(jìn)行60次檢測(cè),響應(yīng)信號(hào)沒有明顯下降。對(duì)空白土壤樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),在加標(biāo)水平為5、10和100μg·kg-1時(shí),獲得的平均回收率為61.5%~106.7%,RSD13.41%;GC-MS法的平均回收率為66.1%~104.5%,RSD11.63%,兩種方法取得了一致的結(jié)果。建立的光纖免疫傳感檢測(cè)技術(shù)具有較寬的線性范圍和較高的靈敏度,樣品僅需簡(jiǎn)單提取,在15min內(nèi)完成測(cè)試,并成功應(yīng)用于設(shè)施菜地土壤中PAEs的檢測(cè)。
【關(guān)鍵詞】：酞酸酯 人工抗原 多克隆抗體 酶聯(lián)免疫分析 光纖免疫傳感器 設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：X833
【目錄】：

• 摘要9-12
• Abstract12-16
• 第一章 文獻(xiàn)綜述16-32
• 1.1 概述16-19
• 1.1.1 PAEs的理化性質(zhì)16-18
• 1.1.2 PAEs的來(lái)源及用途18
• 1.1.3 PAEs的毒性18-19
• 1.2 PAEs的污染途徑19-20
• 1.2.1 增塑劑19-20
• 1.2.2 化妝品20
• 1.2.3 涂料20
• 1.2.4 有機(jī)樹脂廢物20
• 1.3 PAEs污染現(xiàn)狀20-23
• 1.3.1 大氣中的PAEs20-21
• 1.3.2 水體中的PAEs21
• 1.3.3 土壤和沉積物中的PAEs21-23
• 1.3.4 生物及食品中的PAEs23
• 1.4 PAEs的測(cè)定方法23-26
• 1.4.1 分光光度法23-24
• 1.4.2 氣相色譜法24
• 1.4.3 高效液相色譜法24
• 1.4.4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)24-25
• 1.4.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)25
• 1.4.6 免疫分析技術(shù)25-26
• 1.5 酶聯(lián)免疫分析技術(shù)26-28
• 1.5.1 酶聯(lián)免疫分析法的基本原理26
• 1.5.2 酶聯(lián)免疫分析法的常見類型26-27
• 1.5.3 酶聯(lián)免疫分析法在檢測(cè)小分子化合物中的應(yīng)用27-28
• 1.6 光纖免疫傳感檢測(cè)技術(shù)28-31
• 1.6.1 光纖倏逝波免疫傳感器的檢測(cè)原理29
• 1.6.2 光纖倏逝波生物傳感器的分類29-30
• 1.6.3 光纖倏逝波免疫傳感器在環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用30-31
• 1.7 總結(jié)與展望31-32
• 第二章 引言32-38
• 2.1 選題依據(jù)32-33
• 2.2 研究?jī)?nèi)容33-34
• 2.2.1 PAEs半抗原和人工抗原的合成與表征33
• 2.2.2 PAEs多克隆抗體的制備與鑒定33
• 2.2.3 間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定PAEs33-34
• 2.2.4 光纖免疫傳感技術(shù)測(cè)定PAEs34
• 2.3 本研究的意義34
• 2.4 技術(shù)路線34-36
• 2.5 研究目標(biāo)36-38
• 第三章 檢測(cè)酞酸酯半抗原和人工抗原的合成38-50
• 3.1 材料與方法38-40
• 3.1.1 主要試劑與材料38-39
• 3.1.2 試液配制39
• 3.1.3 主要儀器39-40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)步驟與方法40-43
• 3.2.1 半抗原的制備40-42
• 3.2.2 人工抗原的合成42
• 3.2.3 測(cè)定偶聯(lián)物中的蛋白含量42
• 3.2.4 計(jì)算偶聯(lián)物結(jié)合比42-43
• 3.3 結(jié)果與討論43-48
• 3.3.1 半抗原的鑒定43-46
• 3.3.2 偶聯(lián)物的紫外光譜46
• 3.3.3 偶聯(lián)物中的蛋白含量46-48
• 3.3.4 偶聯(lián)物結(jié)合比48
• 3.4 本章小結(jié)48-50
• 第四章 檢測(cè)酞酸酯多克隆抗體的制備與鑒定50-56
• 4.1 材料與方法50-52
• 4.1.1 主要試劑50-51
• 4.1.2 試液配制51-52
• 4.1.3 儀器52
• 4.2 實(shí)驗(yàn)步驟與方法52-54
• 4.2.1 抗血清的制備52-53
• 4.2.2 多克隆抗體的純化53
• 4.2.3 多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定53-54
• 4.3 結(jié)果與討論54-55
• 4.3.1 抗體的效價(jià)54-55
• 4.3.2 抗體中的蛋白含量55
• 4.4 本章小結(jié)55-56
• 第五章 間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定酞酸酯56-70
• 5.1 主要試劑與儀器57
• 5.1.1 主要試劑與材料57
• 5.1.2 試液配制57
• 5.1.3 主要儀器57
• 5.2 GC-MS測(cè)定條件57
• 5.3 實(shí)驗(yàn)步驟與方法57-60
• 5.3.1 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)條件的優(yōu)化57-58
• 5.3.2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線58
• 5.3.3 抗體特異性58-59
• 5.3.4 土壤樣品的采集與處理59
• 5.3.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)59
• 5.3.6 設(shè)施菜地土壤中PAEs的測(cè)定59-60
• 5.4 結(jié)果與討論60-67
• 5.4.1 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的檢測(cè)條件60-63
• 5.4.2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線63-64
• 5.4.3 抗體的特異性64-66
• 5.4.4 加標(biāo)回收率66-67
• 5.4.5 設(shè)施菜地土壤中PAEs的測(cè)定67
• 5.5 本章小結(jié)67-70
• 第六章 光纖免疫傳感器檢測(cè)酞酸酯70-84
• 6.1 主要試劑與儀器70-71
• 6.1.1 主要試劑與材料70-71
• 6.1.2 試液配制71
• 6.1.3 主要儀器71
• 6.2 實(shí)驗(yàn)步驟與方法71-74
• 6.2.1 光纖免疫傳感器的構(gòu)建71-72
• 6.2.2 光纖探頭的制作、清洗與修飾72-73
• 6.2.3 抗體的熒光標(biāo)記73
• 6.2.4 光纖免疫傳感檢測(cè)73
• 6.2.5 光纖免疫傳感檢測(cè)條件的優(yōu)化73
• 6.2.6 光纖免疫傳感檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線73-74
• 6.2.7 抗體特異性74
• 6.2.8 光纖免疫傳感器的再生和穩(wěn)定性74
• 6.2.9 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)74
• 6.2.10 設(shè)施菜地土壤中PAEs的測(cè)定74
• 6.3 結(jié)果與討論74-83
• 6.3.1 光纖免疫傳感檢測(cè)條件的優(yōu)化74-78
• 6.3.2 光纖免疫傳感檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線78-79
• 6.3.3 抗體的特異性79-81
• 6.3.4 光纖免疫傳感器的再生81
• 6.3.5 加標(biāo)回收率81-82
• 6.3.6 設(shè)施菜地土壤中PAEs的測(cè)定82-83
• 6.4 本章小結(jié)83-84
• 第七章 結(jié)論與建議84-86
• 7.1 結(jié)論84
• 7.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)84-85
• 7.3 建議85-86
• 參考文獻(xiàn)86-102
• 致謝102-104
• 攻讀博士學(xué)位期間的科研成果和參加的科研項(xiàng)目104

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳會(huì)明,王超,王星;毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定化妝品中的酞酸酯[J];色譜;2004年03期

  本文關(guān)鍵詞：快速檢測(cè)土壤中酞酸酯的免疫分析技術(shù)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：271663