本文關(guān)鍵詞：基于細(xì)胞芯片的表面等離子體共振成像技術(shù)及其在藥物分析中的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在化工制藥研究中,利用表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技術(shù)評(píng)價(jià)候選藥物與其作用靶點(diǎn)的結(jié)合性能,進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行篩選是藥物開(kāi)發(fā)的重要步驟。作為一種光學(xué)傳感方法,表面等離子體共振技術(shù)具有實(shí)時(shí)、免標(biāo)記、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn),但是傳統(tǒng)的SPR應(yīng)用需要先從細(xì)胞內(nèi)提取、純化目標(biāo)分子,然后將其固定修飾在傳感芯片表面,操作復(fù)雜,耗時(shí)費(fèi)力;此外,離開(kāi)了細(xì)胞環(huán)境,目標(biāo)分子的化學(xué)構(gòu)象及生物活性都可能發(fā)生改變,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,本文利用基于細(xì)胞芯片的表面等離子體共振成像技術(shù)(Surface Plasmon Resonance image,SPRi)原位測(cè)量細(xì)胞表面的生物化學(xué)反應(yīng)。首先,本文利用基于細(xì)胞芯片的SPRi技術(shù)研究了免疫熒光試驗(yàn)中熒光標(biāo)記分子對(duì)細(xì)胞表面生物分子結(jié)合反應(yīng)的影響,說(shuō)明了免標(biāo)記技術(shù)在生物化學(xué)研究中的重要性。該章研究使用帶正電、負(fù)電及電中性的有機(jī)熒光分子標(biāo)記麥芽凝集素(Wheat Germ Agglutinin,WGA),然后分別測(cè)量免標(biāo)記的WGA以及三種被標(biāo)記WGA與細(xì)胞表面糖蛋白受體分子之間的結(jié)合吸附-解離脫附過(guò)程,并通過(guò)改變?nèi)芤弘x子濃度進(jìn)一步驗(yàn)證熒光分子電荷的影響。結(jié)果表明:熒光標(biāo)記分子的電荷性質(zhì)顯著影響細(xì)胞表面配體-受體(Wheat Germ Agglutinin-Glycoprotein)分子之間的結(jié)合吸附過(guò)程以配體分子在細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)的分布區(qū)域。這種影響主要來(lái)源于細(xì)胞膜本身所帶負(fù)電荷,可以促進(jìn)被正電荷熒光分子標(biāo)記的配體分子與細(xì)胞表面受體分子快速結(jié)合;而細(xì)胞膜表面電荷分布不均一,也造成不同熒光分子標(biāo)記的配體分子在細(xì)胞表面結(jié)合的分布區(qū)域存在差異。然后,本文通過(guò)穩(wěn)定光源溫度和鎖定傳感芯片位置,改善了實(shí)驗(yàn)裝置信噪比,實(shí)現(xiàn)了原位監(jiān)測(cè)單克隆抗體藥物分子(Herceptin)與細(xì)胞表面受體分子(Her2)之間的動(dòng)態(tài)結(jié)合過(guò)程,藉此分別測(cè)量了Herceptin分子與不同細(xì)胞系細(xì)胞以及腫瘤組織原代細(xì)胞表面Her2分子之間的鍵合反應(yīng)。結(jié)果表明:不同細(xì)胞系細(xì)胞表面,甚至同一細(xì)胞系不同細(xì)胞表面Herceptin-Her2相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)常數(shù)有明顯差異,這種差異在腫瘤組織的原代細(xì)胞表面表現(xiàn)的更加顯著。從而強(qiáng)調(diào)了免標(biāo)記單細(xì)胞研究的結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。其次,針對(duì)在臨床治療過(guò)程中,腫瘤細(xì)胞會(huì)對(duì)單克隆抗體藥物分子Herceptin產(chǎn)生耐藥性的問(wèn)題,本文測(cè)定了在藥物敏感和藥物耐受細(xì)胞表面,Herceptin-Her2分子間反應(yīng)的結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線,并通過(guò)雙通道熒光染色技術(shù)進(jìn)一步解釋藥物分子在藥物耐受細(xì)胞表面結(jié)合動(dòng)力學(xué)改變的原因。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):由于粘蛋白Muc4的過(guò)度表達(dá)阻礙了部分Herceptin-Her分子反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn),在藥物耐受細(xì)胞表面一些Herceptin分子脫附解離速度顯著增大,無(wú)法有效作用于腫瘤細(xì)胞,導(dǎo)致藥物分子Herceptin的后期治療失敗。最后,本文利用基于細(xì)胞芯片的SPRi技術(shù)研究了新型靶向納米藥物在細(xì)胞表面的結(jié)合性能。本章實(shí)驗(yàn)通過(guò)Protein A分子的共軛螯合作用,制備了表面修飾不同密度靶向識(shí)別分子Herceptin的金納米顆粒(Au NP)作為靶向納米藥物(Herceptin@Au NP),再分別測(cè)定了上述納米藥物在Her2表達(dá)濃度不同的細(xì)胞表面的動(dòng)態(tài)結(jié)合過(guò)程。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):靶向納米藥物(Herceptin@Au NP)表面的識(shí)別分子(Herceptin)密度以及細(xì)胞表面目標(biāo)受體分子(Her2)的表達(dá)濃度都會(huì)顯著影響靶向納米顆粒在細(xì)胞表面的結(jié)合方式。納米顆粒(Au NP)會(huì)影響識(shí)別分子(Herceptin)與受體分子(Her2)之間的結(jié)合性能,靶向納米藥物只有與受體分子(Her2)之間發(fā)生雙(多)鍵合反應(yīng)才能有效結(jié)合在細(xì)胞表面。上述結(jié)論完善了基于細(xì)胞芯片的SPRi技術(shù),拓寬了該技術(shù)的應(yīng)用范圍,強(qiáng)調(diào)了免標(biāo)記單細(xì)胞分析在生物檢測(cè)及藥物分析中的必要性和可靠性;同時(shí)也揭示了電荷對(duì)細(xì)胞表面生物化學(xué)反應(yīng)的影響、闡明了腫瘤細(xì)胞對(duì)單克隆抗體藥物產(chǎn)生耐藥性的動(dòng)力學(xué)機(jī)制、發(fā)現(xiàn)了影響靶向納米顆粒在細(xì)胞表面結(jié)合性能的主要因素。這些都有助于人類進(jìn)一步理解生化反應(yīng)的本質(zhì)、加快新型藥物開(kāi)發(fā)進(jìn)度、提高疾病診療效率。
【關(guān)鍵詞】：表面等離子體共振 細(xì)胞成像 分子相互作用 單克隆抗體 靶向納米藥物
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TQ460.72
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-11
• 1 緒論11-27
• 1.1 研究背景與意義11-12
• 1.2 表面等離子體共振(SPR)簡(jiǎn)介12-16
• 1.2.1 SPR儀器系統(tǒng)12-13
• 1.2.2 SPR定義13-14
• 1.2.3 SPR激發(fā)結(jié)構(gòu)及原理14-16
• 1.3 SPR應(yīng)用技術(shù)的發(fā)展16-22
• 1.3.1 傳統(tǒng)強(qiáng)度檢測(cè)SPR光譜技術(shù)16-18
• 1.3.2 基于微陣列芯片的SPR成像（SPRi）技術(shù)18-19
• 1.3.3 基于細(xì)胞芯片的SPRi技術(shù)19-20
• 1.3.4 基于細(xì)胞芯片的SPRi技術(shù)在生物分析中的優(yōu)勢(shì)20-22
• 1.4 本文內(nèi)容簡(jiǎn)介22-27
• 1.4.1 研究目的22
• 1.4.2 實(shí)驗(yàn)裝置22-24
• 1.4.3 研究?jī)?nèi)容24-27
• 2 熒光標(biāo)記分子對(duì)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)分子間相互作用的影響27-39
• 2.1 本章緒論27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分27-28
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料27-28
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)28
• 2.2.3 儀器裝置28
• 2.2.4 流控系統(tǒng)28
• 2.3 結(jié)果與討論28-37
• 2.3.1 免（有）標(biāo)記探針蛋白結(jié)合動(dòng)力學(xué)的測(cè)量28-29
• 2.3.2 熒光標(biāo)記分子的選擇29-30
• 2.3.3 熒光標(biāo)記分子對(duì)探針蛋白在細(xì)胞表面結(jié)合動(dòng)力學(xué)的影響30-32
• 2.3.4 熒光標(biāo)記分子對(duì)探針蛋白在細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)的影響32-35
• 2.3.5 電荷效應(yīng)35-37
• 2.4 本章小結(jié)37-39
• 3 單克隆抗體藥物Herceptin與細(xì)胞表面Her2 受體之間的結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究39-53
• 3.1 本章緒論39-40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分40-42
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料40
• 3.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染40
• 3.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)40-41
• 3.2.4 免疫熒光41
• 3.2.5 儀器裝置41-42
• 3.3 結(jié)果與討論42-51
• 3.3.1 提高儀器信噪比42-43
• 3.3.2 Herceptin在SKBR3 細(xì)胞表面結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究43-46
• 3.3.3 Herceptin在不同細(xì)胞系細(xì)胞表面結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究46-50
• 3.3.4 Herceptin在原代細(xì)胞表面結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究50-51
• 3.4 本章小結(jié)51-53
• 4 腫瘤細(xì)胞對(duì)單克隆抗體藥物Herceptin的耐藥機(jī)制研究53-65
• 4.1 本章緒論53-54
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分54-57
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料54-55
• 4.2.2 耐藥細(xì)胞篩選55-56
• 4.2.3 免疫熒光56-57
• 4.2.4 儀器裝置57
• 4.3 結(jié)果與討論57-63
• 4.3.1 Herceptin在藥物敏感和藥物耐受細(xì)胞表面結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究57-59
• 4.3.2 單細(xì)胞耐藥指數(shù)測(cè)定59-61
• 4.3.3 細(xì)胞耐藥機(jī)制研究61-63
• 4.4 本章小結(jié)63-65
• 5 靶向納米顆粒在細(xì)胞表面的結(jié)合機(jī)制研究65-77
• 5.1 本章緒論65
• 5.2 實(shí)驗(yàn)部分65-66
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料65-66
• 5.2.2 制備靶向納米顆粒 (Herceptin@AuNP)66
• 5.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)66
• 5.2.4 儀器裝置66
• 5.3.結(jié)果與討論66-76
• 5.3.1 Herceptin@AuNP在SKBR3 細(xì)胞表面的結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究66-72
• 5.3.2 Herceptin@AuNP在JIMT1 細(xì)胞表面的結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究72-74
• 5.3.3 識(shí)別分子Herceptin密度對(duì)靶向納米顆粒結(jié)合性能的影響74-76
• 5.4 本章小結(jié)76-77
• 6 結(jié)論與展望77-79
• 6.1 本文結(jié)論77-78
• 6.2 展望78-79
• 參考文獻(xiàn)79-89
• 致謝89-91
• 附錄91-95
• A．結(jié)合動(dòng)力學(xué)模型91-95
• A1. 單鍵合模型91-93
• A2. 雙組份模型93-94
• A3. 雙鍵合模型94-95
• B．作者在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文95
• B1. 表面等離子體共振成像領(lǐng)域95
• B2. 其他領(lǐng)域論文95

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 盧晉;基于表面等離子體的電化學(xué)技術(shù)在生物分析中的應(yīng)用[D];清華大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：基于細(xì)胞芯片的表面等離子體共振成像技術(shù)及其在藥物分析中的應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：258750