本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌硝基還原酶NfsB的分子改造及其催化特性，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：硝基還原酶是一類分布廣泛的黃素蛋白酶,與輔基FMN或FAD分子結(jié)合,以NAD(P)H作為電子供體催化硝基基團生成相應(yīng)的羥胺或氨基基團。因此,該類酶在污染物環(huán)境修復(fù)、芳香羥胺類藥物中間體的生物合成和癌癥前藥激活等諸多領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。本論文以大腸桿菌硝基還原酶NfsB作為研究對象,以環(huán)境污染物2,4,6-三硝基甲苯(TNT)、芳香羥胺合成原料2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT)和癌癥治療前藥CB1954作為底物,利用HPLC 、MS和酶動力學(xué)等方法分析NfsB催化不同硝基化合物還原的產(chǎn)物、催化活性及區(qū)位選擇性。結(jié)合定點突變、結(jié)晶學(xué)和分子對接模擬等手段探討了NfsB催化活性和區(qū)位選擇性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),并改造獲得催化活性或區(qū)位選擇性更好的突變體酶。本論文主要結(jié)果如下：(1) NfsA和NfsB對TNT表現(xiàn)出類似的催化活性,經(jīng)HPLC-MS產(chǎn)物分析表明二者催化TNT還原生成2,4-二羥胺-6-硝基甲苯(2,4-DHANT)的途徑相同。當(dāng)氧氣存在時,TNT還原過程中的4-羥胺-2,6-二硝基甲苯(4-HADNT)和亞硝基中間產(chǎn)物可縮合生成相應(yīng)的氧化偶氮化合物�；蚨c突變研究表明,殘基F123對酶催化活性影響較大。突變體F123A對污染物TNT及其氨基衍生物2-氨基-4,6-二硝基甲苯(2-ADNT)和4-氨基-2,6-二基甲苯(4-ADNT)的催化活性較野生型酶分別提高了1.4倍、3.6倍和4.0倍。(2)基因改造NfsB實現(xiàn)對2,4-DNT的區(qū)位選擇性還原的改變。野生型NfsB能夠?qū)Ｒ恍赃�原2,4-DNT的4位硝基。為了獲得2位硝基的還原活性,對可能影響區(qū)位選擇性的位點(T41、F70、N71和F124)進行單點突變和組合突變。三突變體T41L/N71S/F124W可以實現(xiàn)2,4-DNT的2位硝基還原,并解析獲得其晶體結(jié)構(gòu)。與野生型NfsB晶體結(jié)構(gòu)比較,我們發(fā)現(xiàn)三突變體與野生型酶在整體結(jié)構(gòu)上十分相似,但在活性口袋內(nèi)部存在明顯的結(jié)構(gòu)差異：突變體中L41能夠與W124相互作用,從而在FMN異咯嗪環(huán)的上方形成一個疏水性更強的底物結(jié)合區(qū)域；F70和W124的芳環(huán)側(cè)鏈朝向活性口袋外側(cè)發(fā)生翻轉(zhuǎn),入口處較野生型酶更寬。(3)分子對接結(jié)果顯示,底物2,4-DNT在野生型NfsB和突變體T41L/N71S/F124W活性口袋中結(jié)合方式完全不同。在野生型NfsB中,2,4-DNT僅呈現(xiàn)一種構(gòu)象,即4位硝基插入由T41、E165、G166和F124形成的口袋中,在FMN的N5原子上方實現(xiàn)還原反應(yīng)；而在突變體酶中,底物2,4-DNT采用了一種與野生型酶中完全不同的結(jié)合模式,即1位甲基與L41、W124形成疏水相互作用插入活性口袋內(nèi)部,從而使其鄰近的2位硝基位于FMN的N5原子上方實現(xiàn)還原反應(yīng)。(4)為了提高NfsB對癌癥前藥CB1954的催化活性并實現(xiàn)對酶區(qū)位選擇性的改變,對影響酶催化活性和區(qū)位選擇性的位點(T41、N71、F123和F124)進行單點突變和組合突變。結(jié)果表明,單突變體F124W可實現(xiàn)對CB1954的4位硝基的專一性還原：同時突變N71或F123可與F124W協(xié)同增加催化活性,而對其區(qū)位選擇性沒有影響；三突變體N71S/F123A/F124W除實現(xiàn)對CB1954的4位硝基的專一性還原外,催化活性也較野生型酶提高了21.1倍。(5)解析獲得突變體N71S/F123A/F124W的晶體結(jié)構(gòu)。與已知晶體結(jié)構(gòu)比較,我們發(fā)現(xiàn)突變體中W124較大的吲哚環(huán)可以實現(xiàn)與CB1954中氮雜環(huán)較強的堆積作用,使其鄰近的4位硝基位于FMN的N5原子上方位置,從而實現(xiàn)其專一性還原；F123A突變?yōu)閃124殘基側(cè)鏈提供了更大的活動空間,有利于催化過程中構(gòu)象變化,且N71S突變使得鄰近F70的芳香側(cè)鏈偏轉(zhuǎn)、活性口袋入口處變寬,有利于底物的進入,從而提高突變體酶對CB 1954的催化活性。
【關(guān)鍵詞】：硝基還原酶 定點突變 大腸桿菌 2 4 6-三硝基甲苯 CB1954
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：X172;O629.8
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• TABLE OF CONTENTS11-14
• 圖目錄14-16
• 表目錄16-17
• 主要符號表17-18
• 1 文獻綜述18-47
• 1.1 硝基還原酶概述18-25
• 1.1.1 硝基還原酶的分類18-19
• 1.1.2 硝基還原酶的應(yīng)用19-25
• 1.2 硝基還原酶的序列及結(jié)構(gòu)特征25-34
• 1.2.1 細(xì)菌硝基還原酶的序列特征26-28
• 1.2.2 細(xì)菌硝基還原酶的晶體結(jié)構(gòu)28-30
• 1.2.3 輔基FMN的結(jié)合和構(gòu)象變化30-32
• 1.2.4 底物結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)特征32-34
• 1.3 硝基還原酶的催化機制和關(guān)鍵氨基酸殘基34-45
• 1.3.1 硝基還原酶的催化機制34-35
• 1.3.2 硝基還原酶的底物多樣性及其分子機制35-36
• 1.3.3 硝基還原酶的區(qū)位選擇性及其分子機制36-39
• 1.3.4 大腸桿菌硝基還原酶NfsB的關(guān)鍵氨基酸殘基39-45
• 1.4 本論文的選題依據(jù)和研究內(nèi)容45-47
• 1.4.1 選題依據(jù)45
• 1.4.2 研究內(nèi)容45-47
• 2 NfsB催化TNT還原途徑及基因改造47-69
• 2.1 引言47
• 2.2 實驗材料與方法47-51
• 2.2.1 NfsA和NfsB的克隆表達及純化47-48
• 2.2.2 TNT及其氨基衍生物的還原產(chǎn)物分析48-49
• 2.2.3 NfsB突變體的克隆、表達及純化49
• 2.2.4 NfsA、NfsB及其突變體的酶催化動力學(xué)分析49-50
• 2.2.5 分子對接50-51
• 2.3 實驗結(jié)果51-64
• 2.3.1 NfsB催化TNT還原產(chǎn)物分析51-54
• 2.3.2 NfsB催化2-ADNT和4-ADNT的還原產(chǎn)物分析54-56
• 2.3.3 NfsA與NfsB還原TNT的產(chǎn)物和催化活性比較56-57
• 2.3.4 NfsB突變位點選擇57-59
• 2.3.5 NfsB突變體構(gòu)建及其表達純化59-61
• 2.3.6 NfsB突變體還原TNT及氨基衍生物的動力學(xué)分析61-64
• 2.4 分析討論64-68
• 2.4.1 NfsA和NfsB催化TNT還原途徑64-65
• 2.4.2 F123和F124對NfsB催化活性的影響65-66
• 2.4.3 F124W對2-ADNT和4-ADNT催化活性差異的分子機制66-68
• 2.5 本章小結(jié)68-69
• 3 基因改造NfsB還原2,4-DNT的區(qū)位選擇性及其分子機制69-92
• 3.1 引言69
• 3.2 實驗材料與方法69-74
• 3.2.1 NfsB催化2,4-DNT和2,4-DNAN的還原產(chǎn)物分析69-70
• 3.2.2 NfsB突變體的克隆、表達與純化70
• 3.2.3 NfsB及其突變體還原2,4-DNT和2,4-DNAN的動力學(xué)分析70-72
• 3.2.4 蛋白的純化及結(jié)晶前預(yù)處理72
• 3.2.5 蛋白結(jié)晶條件的篩選和優(yōu)化72-73
• 3.2.6 X-射線衍射數(shù)據(jù)的收集73
• 3.2.7 晶體結(jié)構(gòu)的解析和修正73
• 3.2.8 分子對接73-74
• 3.3 實驗結(jié)果74-89
• 3.3.1 野生型NfsB催化2,4-DNT還原產(chǎn)物分析74-75
• 3.3.2 定點突變改變NfsB還原2,4-DNT的區(qū)位選擇性75-79
• 3.3.3 底物取代基對NfsB區(qū)位選擇性的影響79-83
• 3.3.4 NfsB及其突變體催化2,4-DNT和2,4-DNAN還原的動力學(xué)分析83
• 3.3.5 突變體T41L/N71S/F124W晶體生長、衍射數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)解析83-86
• 3.3.6 突變體T41L/N71S/F124W與野生型NfsB晶體結(jié)構(gòu)比較86-87
• 3.3.7 NfsB及其突變體還原二硝基化合物的區(qū)位選擇性的分子機制87-89
• 3.4 分析討論89-90
• 3.5 本章小結(jié)90-92
• 4 基因改造NfsB還原CB1954的區(qū)位選擇性及其分子機制92-104
• 4.1 引言92
• 4.2 實驗材料與方法92-94
• 4.2.1 NfsB突變體的克隆、表達與純化92
• 4.2.2 NfsB及其突變體還原CB1954的區(qū)位選擇性分析92-94
• 4.2.3 NfsB及其突變體還原CB1954的催化動力學(xué)分析94
• 4.2.4 蛋白結(jié)晶、數(shù)據(jù)收集和解析94
• 4.3 實驗結(jié)果94-101
• 4.3.1 野生型NfsA和NfsB催化CB1954還原產(chǎn)物分析94-95
• 4.3.2 殘基41和124對CB1954區(qū)位選擇性的影響95-96
• 4.3.3 殘基41、71、123和124對CB1954催化活性的影響96-97
• 4.3.4 殘基41、71、123和124的協(xié)同效應(yīng)97-99
• 4.3.5 突變體N71S/F123A/F124W與野生型NfsB的晶體結(jié)構(gòu)比較99-101
• 4.4 分析討論101-102
• 4.4.1 NfsB區(qū)位選擇性還原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)101
• 4.4.2 關(guān)鍵氨基酸之間的協(xié)同效應(yīng)101-102
• 4.5 本章小結(jié)102-104
• 5 結(jié)論與展望104-106
• 5.1 結(jié)論104-105
• 5.2 創(chuàng)新點摘要105
• 5.3 有待深入研究的內(nèi)容105-106
• 參考文獻106-114
• 攻讀博士學(xué)位期間科研項目及科研成果114-115
• 致謝115-116
• 作者簡介116

  本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌硝基還原酶NfsB的分子改造及其催化特性，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：253328