【摘要】：抗凍蛋白(AFP)是一種對(duì)冰晶的生長(zhǎng)和重結(jié)晶有抑制作用的特殊蛋白質(zhì),具有熱滯效應(yīng)(THA)、抑制重結(jié)晶效應(yīng)(RI)、修飾冰晶形態(tài)效應(yīng)三個(gè)基本特征。由于其具有阻止冰晶生長(zhǎng)、抑制冰晶重結(jié)晶而使生命有機(jī)體免受結(jié)冰破壞的特點(diǎn),AFPs有望在冷凍食品的保鮮方面發(fā)揮重大作用,成為一種有前景的冷凍食品添加劑。本文從冷誘導(dǎo)的燕麥籽粒中分離純化得到一種新型的植物抗凍蛋白(AsAFP),經(jīng)序列鑒定后對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析;利用同源建模對(duì)AsAFP進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的模建,對(duì)AsAFP和冰晶面復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬,通過分子模擬技術(shù)分析其抗凍機(jī)理,為抗凍蛋白的研究實(shí)驗(yàn)提供了理論指導(dǎo);并將AsAFPs應(yīng)用于冷凍面團(tuán)及濕面筋蛋白中,對(duì)凍藏過程中冷凍面團(tuán)的理化特性和最終饅頭制品的質(zhì)構(gòu),以及濕面筋蛋白的聚集行為、凍融特性、理化特性等進(jìn)行了研究。論文首先從冷誘導(dǎo)的燕麥籽粒中經(jīng)過一系列的分離純化步驟,得到電泳純的AsAFP,熱滯活性為1.24°C,通過MALDI-TOF-MS/MS法進(jìn)行序列鑒定,并對(duì)其氨基酸組成、等電點(diǎn)及相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)結(jié)構(gòu)及表面溶劑可及性等進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明:AsAFP的氨基酸序列為VSSVISSSLF EKMLLHRGFY TYDAFIAAAK SFPAFATTGS TDVRKREVAA FLAQTSHETT GGWPTAPDGP YELGSTSDYF GRGPIQISYN YNYGAAGKAI GVDLLRNPDL VTSDNTVEFK TALWFWMTPQ SPKPSSHDVI TGRWSPSSTD KAAGRVPGYG VLTNIIDGGV ECGKGQESHV ADRIGYYKDN LDCYNQKPFA,與Endochitinase具有最大匹配度;AsAFP具有高親水性氨基酸殘基比例;其理論等電點(diǎn)為6.08,相對(duì)分子質(zhì)量為21728.18;二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有大量的無規(guī)則結(jié)構(gòu),富含α-螺旋結(jié)構(gòu),且具有較高的表面溶劑可及性。以AsAFP氨基酸序列為探針,對(duì)AsAFP進(jìn)行同源建模,將模建的蛋白與不同冰晶面進(jìn)行對(duì)接,計(jì)算結(jié)合能量,并對(duì)AsAFP和冰晶層復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。4DWX被認(rèn)為是AsAFP的同源建模最佳模板,序列一致性達(dá)63%,序列覆蓋度達(dá)100%;以4DWX的三維結(jié)構(gòu)為模板,采用modeller 9.14單模板建模并進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,構(gòu)建出準(zhǔn)確性較高的AsAFP模型;以分子對(duì)接方法預(yù)測(cè)AsAFP和冰晶層復(fù)合物的結(jié)合模型,對(duì)接結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn),AsAFP的遙爪結(jié)構(gòu)(由Helix和loop組成)是其與冰晶結(jié)合的主要位點(diǎn),氫鍵作用和疏水相互作用在AsAFP和冰晶層的穩(wěn)定結(jié)合中起到關(guān)鍵的作用,Asn、Arg和Ser等氨基酸殘基參與形成氫鍵;對(duì)AsAFP和冰晶層復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬,分子動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)表明,AsAFP和冰晶層在動(dòng)力學(xué)模擬過程中表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性,隨著時(shí)間的推移,回轉(zhuǎn)半徑、氫鍵數(shù)量、二級(jí)結(jié)構(gòu)和溶劑可及表面保持平衡,進(jìn)一步說明了AsAFP-冰晶層復(fù)合物結(jié)合的緊密;由于AsAFP與Prism型晶面在動(dòng)力學(xué)模擬過程中產(chǎn)生的氫鍵數(shù)量最大,結(jié)合穩(wěn)定性最優(yōu),使其表現(xiàn)出的抗凍性更高。將AsAFPs添加到冷凍面團(tuán)中,研究了凍藏過程中AsAFPs對(duì)冷凍面團(tuán)的影響。研究表明:凍藏過程引起了面團(tuán)體系可凍結(jié)水含量的增加,而AsAFPs的親水性使其可以吸附在自由水附近,限制水分的自由移動(dòng),從而顯著減緩可凍結(jié)水含量增加的幅度,而可凍結(jié)水含量決定了面團(tuán)在凍藏過程中冰晶形成的數(shù)量,因此AsAFPs可以有效抑制凍藏過程中面團(tuán)體系冰晶的形成;AsAFPs的存在可以降低面團(tuán)水分流動(dòng)性,抑制凍藏過程中強(qiáng)結(jié)合水的流失;降低凍藏過程中冷凍面團(tuán)G'和G'的下降趨勢(shì),增強(qiáng)冷凍面團(tuán)的產(chǎn)氣和持氣能力,提高酵母菌的存活率,保護(hù)面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu);提高饅頭最終品質(zhì),使饅頭制品更柔軟,提高饅頭制品的黏聚性和回彈性。將AsAFPs添加到面筋蛋白中,研究了凍藏過程中AsAFPs對(duì)面筋蛋白的影響。對(duì)面筋蛋白、麥谷蛋白、麥醇溶蛋白聚集行為的研究表明:凍藏過程中,面筋蛋白和麥谷蛋白中的GMP隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生了不同程度的解聚,麥醇溶蛋白分子量分布范圍發(fā)生改變。AsAFPs的加入可以通過抑制冰晶形成和重結(jié)晶,減少凍結(jié)及凍藏對(duì)面筋網(wǎng)絡(luò)的破壞,保護(hù)面筋蛋白在凍藏過程中免受冰晶形成所造成的機(jī)械破壞,從而減緩面筋蛋白和麥谷蛋白的解聚,減小麥醇溶蛋白在凍藏過程中造成的機(jī)械損傷;SDS-PAGE電泳研究發(fā)現(xiàn),凍藏對(duì)還原后的面筋蛋白和麥谷蛋白亞基并無影響;但面筋蛋白、麥谷蛋白、麥醇溶蛋白的自由巰基含量均有所增加,可見凍藏過程中二硫鍵的斷裂是導(dǎo)致高聚物發(fā)生解聚的主要原因。AsAFPs的添加可以減少二硫鍵的斷裂,降低自由巰基含量的增加。對(duì)面筋蛋白凍融特性的研究表明:對(duì)新鮮面筋蛋白而言,AsAFPs的添加可以增大面筋蛋白的熔融溫度區(qū)間,降低面筋蛋白樣品的熔融焓和可凍結(jié)水含量,提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度;而對(duì)于冷凍面筋蛋白,AsAFPs的添加可以降低水分流動(dòng)性、熔融焓和可凍結(jié)水含量;對(duì)面筋蛋白流變學(xué)性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和微觀性質(zhì)的研究表明:AsAFPs可以減緩凍藏過程中冷凍面筋蛋白G'和G'的下降趨勢(shì),保護(hù)面筋蛋白的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)免受冰晶損傷,保護(hù)面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TS210.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2429687