【摘要】：丙烯酰胺(acrylamide,AA)是富含碳水化合物的食品在熱加工過程中產生的2A類致癌物,職業(yè)暴露研究及體內動物實驗均表明AA具有神經毒性,并存在潛在的遺傳毒性、肝臟毒性等。氧化應激及下游相關通路的激活可能是AA引起體內毒性的機制之一。本研究利用小鼠原代神經膠質細胞模型,探討了AA造成氧化應激并導致神經毒性的分子機制。進而應用天然抗氧化劑--藍莓花色昔提取物在昆明小鼠模型上,對AA所引起的氧化應激進行干預,并探討可能的干預機制。主要的結果及結論如下:(1)通過免疫磁珠分選法,建立了原代星型膠質細胞和小膠質細胞純培養(yǎng)模型。選取新生48 h內小鼠,斷頭取腦,除去腦膜及明顯血管,過篩后在細胞培養(yǎng)瓶中進行貼壁培養(yǎng),期間去除少突膠質細胞,待9-14天后星型膠質及小膠質細胞完全成熟,利用特異性抗體CD11+結合磁珠分選的方法,分別獲得星型膠質及小膠質細胞純培養(yǎng)體系,并運用免疫熒光雙染法鑒定其純度,取純度大于90%的細胞做為后續(xù)實驗的研究材料。(2)通過MTT染色、測定活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)含量、還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量及GSH與氧化性谷胱甘肽的比值的測定,分別在星型膠質細胞和小膠質細胞中,對AA染毒劑量進行了篩選。結果表明細胞毒性、自由基含量及GSH的損失都與AA染毒濃度呈正相關。并最終確定O.1mM和1.0mMAA做為后續(xù)探究氧化應激相關通路的最適作用濃度。在兩種細胞模型上,AA引起的ROS產生了典型的過氧化產物4-羥基壬烯醛和8-羥基脫氧鳥苷,并且進一步促進了 Nrf2及NF-κB轉移因子的入核,激活了下游相關通路;其中,Nrf2入核時間早于NF-κB,其下游抗氧化相關基因血紅素單加氧酶(HemeOxygenase1,HO1)、NADPH脫氫酶(NAD(P)Hq uinone dehydrogenase 1,NQO1)、谷胱甘肽巰基轉移酶(GlutathioneS-transferase,GST)在mRNA和蛋白的表達水平均有顯著提高,以抵抗AA所產生的ROS。隨著AA染毒時間延長或劑量升高,其抗氧化相關的代償鏈崩潰,NF-κB入核激活下游與炎癥相關通路,白細胞介素(Interleukin,IL)IL1-β、IL6、腫瘤壞死因子(Tumor necrosisfactor,TNF)TNF-α在細胞上清中被檢出,細胞活力下降,最終導致死亡。相比于星型膠質細胞,AA毒性會在小膠質細胞中引起更多ROS蓄積、加速GSH耗竭、加快氧化產物的生成,更快速激活氧化應激相關的Nrf2、NF-κB通路及下游基因,導致細胞死亡率增加。(3)通過MTT染色、測定ROS含量、GSH含量及GSH與氧化性谷胱甘肽的比值在星型膠質/小膠質細胞共培養(yǎng)模型上進行了 AA染毒劑量的篩選,細胞毒性、自由基含量及GSH的損失都與AA濃度呈劑量效應關系。在共培養(yǎng)模型上,高劑量1.0mMAA能夠顯著提高4-羥基壬烯醛和8-羥基脫氧鳥昔的生成量,并進一步促進Nrf2及NF-κB轉移因子入核,進而導致下游相關酶HO1、NQO1、GST/IL1-β、IL6、TNF-α順次激活。類似于純培養(yǎng),Nrf2的入核時間早于NF-κB。不同于兩種純培養(yǎng)模型,共培養(yǎng)Nrf2及NF-κB的激活速率介于兩者之間,即快于星型膠質細胞而慢于小膠質細胞。(4)通過對差異表達蛋白的篩選及對比,利用IPA軟件對其所影響的經典通路、上游調節(jié)元件、蛋白互作網絡、主要生物功能進行分析,得出過多ROS的產生,從而導致的細胞氧化損傷是AA介導的神經毒性發(fā)生的主要原因之一。并且Nrf2和NF-κB通路可能是受AA毒性影響的主要通路,MAPK等磷酸化通路的改變可能是Nrf2和NF-κB激活的原因。本章蛋白組學結果預測與前兩章的實際觀測結果吻合。(5)藍莓花色苷提取物(Blueberry anthocyanins extract,BAE)對AA體內干預的結果表明,50-250 mg/kg b.w./day的BAE能夠抑制AA染毒小鼠肝臟線粒體中ROS的產生,恢復線粒體電子傳遞鏈復合物以及ATP水解酶酶活,改善線粒體內膜磷脂氧化及阻止膜電位消失,減少細胞色素c外漏并防止線粒體發(fā)生腫脹。推測BAE抑制AA所產生的氧化應激與其保護線粒體功能性密切相關。
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【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TS201.6

【參考文獻】

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1 敬海明;李國君;;毒理蛋白質組學研究進展[J];國外醫(yī)學(衛(wèi)生學分冊);2009年06期

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本文編號：2420192