【摘要】：檸檬酸(2-羥基丙烷-1,2,3-三羧酸,citric acid)來源于三羧酸循環(huán)的中間代謝,是一種非常重要的平臺化合物,也是當前世界上產(chǎn)量和消費量最大的食用有機酸。黑曲霉發(fā)酵淀粉質(zhì)原料合成檸檬酸是當前的主要生產(chǎn)方式。盡管已成為發(fā)酵工業(yè)中最重要的大宗發(fā)酵產(chǎn)品之一,檸檬酸在其生產(chǎn)過程中仍存在著淀粉質(zhì)原料液化缺乏科學(xué)評價標準、種子培養(yǎng)過程繁瑣且不穩(wěn)定、原料利用不完全及發(fā)酵模式能效低等在發(fā)酵工業(yè)中非常具有代表性的問題。本論文通過解析黑曲霉糖化酶催化效率-糊精分子量之間的關(guān)系,建立了基于糊精分子量特征的淀粉質(zhì)原料液化效果評價方法;依據(jù)黑曲霉生理學(xué)特性及形態(tài)學(xué)特征,研究超聲預(yù)處理孢子及菌絲球分散技術(shù),從而構(gòu)建了種子循環(huán)培養(yǎng)工藝;集成分割發(fā)酵技術(shù)與菌絲球分散技術(shù)策略,建立了分割循環(huán)發(fā)酵工藝;運用階段添加糖化酶的手段,保障了葡萄糖供應(yīng)與消耗速率的匹配,實現(xiàn)了檸檬酸產(chǎn)量及原料利用率的提升。主要研究結(jié)果如下:(1)建立了基于糊精分子量特征評價淀粉質(zhì)原料液化的方法。采用乙醇分級沉淀方法制備分子量分布集中的糊精樣品;發(fā)酵菌種黑曲霉培養(yǎng)液經(jīng)分離純化,獲得了電泳純糖化酶的三個同工酶(Glucoamylase,GM),其中GM I,GM II,GM III亞基分子量分別為30 kDa,50 kDa,100 kDa�；诤谇固腔复呋c糊精分子量構(gòu)效關(guān)系,建立了基于糊精分子量特征評價淀粉質(zhì)原料液化水平的方法。液化糊精組分Mw為1.9 kDa時,Km值最小即糖化酶與糊精親和力最高,液化組分Mw集中在1.4~1.9 kDa范圍內(nèi),有助于提升后期糖化效率。進一步地,精細化調(diào)控了淀粉質(zhì)原料液化組分,與基于DE值的傳統(tǒng)液化評價效果相比,液化糊精更易被糖化酶作用;液化組分用于檸檬酸發(fā)酵,檸檬酸合成速率與總糖消耗速率明顯改善,發(fā)酵周期縮短9 h,殘總糖降低10.8%,發(fā)酵產(chǎn)率提高21.1%。(2)超聲波預(yù)處理孢子,促進了孢子水分滲透,加快孢子萌發(fā)。依據(jù)黑曲霉孢子萌發(fā)的生理特性,超聲波預(yù)處理孢子促進孢子水分滲透,誘導(dǎo)孢子快速萌發(fā),縮短種子培養(yǎng)時間,應(yīng)用于發(fā)酵可使產(chǎn)率提高8.13%。在發(fā)酵罐水平上系統(tǒng)研究其整個生命過程中生理學(xué)特性及生長動力學(xué)參數(shù),發(fā)現(xiàn)黑曲霉分泌糖化酶能力能夠直觀反映種子細胞活力,可以作為移種的特征指標,能有效避免基于種齡的傳統(tǒng)移種方式引起發(fā)酵菌種活力波動的問題。組合超聲波誘導(dǎo)孢子萌發(fā)與糖化酶活力表征的移種策略,顯著提升了移入發(fā)酵的菌種活力,縮短產(chǎn)酸調(diào)整期,發(fā)酵產(chǎn)率提升11.76%,總發(fā)酵時間縮短7.9 h。(3)基于菌絲球分散技術(shù)構(gòu)建了種子循環(huán)培養(yǎng)工藝。針對種子傳統(tǒng)培養(yǎng)周期長的問題,提出采用菌絲球替代傳統(tǒng)孢子接種工藝,有效避免了種子傳統(tǒng)培養(yǎng)模式繁瑣的問題(批量培養(yǎng)孢子制備超過30 d);在此基礎(chǔ)上,采用菌絲球分散技術(shù),突破了種子連續(xù)培養(yǎng)中菌絲體結(jié)構(gòu)引起活力下降的瓶頸,構(gòu)建了種子循環(huán)培養(yǎng)工藝,種子循環(huán)培養(yǎng)八批次,種子仍然維持較高的活力;循環(huán)培養(yǎng)的種子以分散形態(tài)接種發(fā)酵明顯優(yōu)于菌絲球形態(tài),連續(xù)培養(yǎng)八批次,發(fā)酵過程穩(wěn)定,檸檬酸平均產(chǎn)量比菌絲球形態(tài)接種提高了26.5%,甚至比初始對照組提高2.5%。(4)集成菌絲球分散技術(shù)與分割發(fā)酵策略構(gòu)建了分割循環(huán)發(fā)酵工藝。分割發(fā)酵策略實現(xiàn)菌體生長與檸檬酸合成有效分離,在菌絲球形態(tài)的分割循環(huán)發(fā)酵過程中,菌絲體形態(tài)特征限制了菌體生長與檸檬酸積累,通過菌絲球分散技術(shù)有效控制分割循環(huán)發(fā)酵過程中菌絲體形態(tài)特征,連續(xù)發(fā)酵六批次,發(fā)酵菌絲球形態(tài)穩(wěn)定,檸檬酸產(chǎn)量由70.3 g·L~( 1)提高至97.0 g·L~( 1),但仍低于對照組;進一步地,在優(yōu)化的分割發(fā)酵條件下(分割比例2/10(v·v 1),限制性氮源供應(yīng)量15 g·L~( 1),分割時機24 h),分割循環(huán)發(fā)酵十批次,發(fā)酵過程穩(wěn)定且檸檬酸產(chǎn)量比對照提高了1.26%,總糖消耗量降低10.01%,顯著提高了檸檬酸生產(chǎn)效率。(5)階段添加糖化酶策略,保障了檸檬酸合成期葡萄糖供應(yīng)速率,改善檸檬酸合成效率。針對發(fā)酵殘總糖偏高的問題,解析了商品糖化酶與黑曲霉自身分泌的糖化酶pH耐受性,發(fā)現(xiàn)商品糖化酶在低pH條件下穩(wěn)定性更高;提出在發(fā)酵開始前預(yù)加商品糖化酶糖化2 h(60°C)再進行正常發(fā)酵方式,發(fā)酵殘總糖下降10.4%,生產(chǎn)強度提升了0.11 g·L~( 1)·h~( 1),但發(fā)酵初始高濃度葡萄糖抑制細胞生長,發(fā)酵中后期糖化酶活力損失嚴重;進一步地,在發(fā)酵過程添加糖化酶,運用階段添加糖化酶手段,有效補償了發(fā)酵過程中因pH急劇下降導(dǎo)致的酶活力損失,保障葡萄糖供應(yīng)速率,發(fā)酵產(chǎn)率提升13.3%,發(fā)酵殘?zhí)墙档?1.3%,簡化了后期發(fā)酵產(chǎn)物分離與提取工藝。
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【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TQ921.1

【參考文獻】

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本文編號：2412940