發(fā)布時(shí)間：2019-01-19 21:36

【摘要】：納米材料通常是特征尺寸在1-100nm的極細(xì)材料,容易通過(guò)吸入,攝入及皮膚接觸進(jìn)入生物體內(nèi)。納米材料的種類繁多,在涂料、催化劑、半導(dǎo)體、化妝品、食物添加劑、電子元件和藥物載體等商業(yè)化產(chǎn)品有著廣泛的應(yīng)用。研究表明,隨著人體接觸納米材料的機(jī)會(huì)增加,納米材料作用于人體會(huì)導(dǎo)致一系列的生物學(xué)反應(yīng)。因此,納米材料的生物安全性日益引起人們的關(guān)注。目前,納米毒理學(xué)還沒有建立一套獨(dú)立,完善的納米材料毒性評(píng)價(jià)方法,其主要檢測(cè)手段主要是借鑒傳統(tǒng)的環(huán)境有毒物毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法。而納米材料獨(dú)特的顆粒效應(yīng),亟需發(fā)展一種準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)便、并適于納米材料毒性評(píng)估的檢測(cè)方法。本論文首先構(gòu)建了以AP-1、BTG2、IL8啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的雙熒光報(bào)告質(zhì)粒(pAP1-MC-EGFP、pBTG2-MC-EGFP 及 pIL8-MC-EGFP),均以綠色熒光蛋白EGFP和紅色焚光蛋白mCherry為報(bào)告基因,組成型啟動(dòng)子(cytomegalovirus,CMV)控制下游的綠色熒光蛋白EGFP,而誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(AP-1、BTG2或IL8啟動(dòng)子)控制下游紅色熒光蛋白mCherry表達(dá)。組成型表達(dá)的EGFP用于監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率,而誘導(dǎo)型表達(dá)的mCherry熒光信號(hào)用于精準(zhǔn)反映啟動(dòng)子的活性。將上述三種雙熒光報(bào)告基因質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞,建立相應(yīng)的細(xì)胞生物傳感器,用于反映致癌毒性、DNA損傷及炎癥反應(yīng)。通過(guò)對(duì)細(xì)胞生物傳感器的優(yōu)化,成功將其應(yīng)用于納米材料生物毒性效應(yīng)的評(píng)估及環(huán)境因子對(duì)納米材料生物毒性效應(yīng)的影響,初步探討納米材料暴露下細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制,從而為研究納米材料影響胞內(nèi)特定基因的表達(dá)提供重要信息。同時(shí),結(jié)合傳統(tǒng)的生物毒性檢測(cè)手段,采用細(xì)胞生物傳感器初步探究了納米氧化鈦的細(xì)胞毒性和基因毒性。本論文主要研究方結(jié)果如下:1、本論文構(gòu)建了新型的雙熒光報(bào)告質(zhì)粒pAP1-MC-EGFP、pBTG2-MC-EGFP、pIL8-MC-EGFP,分別建立傳感器細(xì)胞 H1299-AP1、H1299-BTG2、H1299-IL8,通過(guò)比較細(xì)胞類型、培養(yǎng)條件、流式分析策略等對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,對(duì)該細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)納米材料生物毒性的實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行了優(yōu)化。在檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性等方面得到顯著提高。同時(shí),與傳統(tǒng)的生物檢測(cè)方法(Western Blot、RT-PCR、免疫熒光細(xì)胞化學(xué))得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比,細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)結(jié)果與其具有良好的·致性。2、利用流式細(xì)胞術(shù),將細(xì)胞生物傳感器成功應(yīng)用于納米材料生物毒性的檢測(cè)。結(jié)果顯示,不同種類的納米材料引起的基因轉(zhuǎn)錄活性差異很大。其中,碳族納米材料基本不影響胞內(nèi)AP-1啟動(dòng)了的轉(zhuǎn)錄活性,而金屬及金屬氧化物納米材料增高了胞內(nèi)三種啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,且存在濃度依賴性,具有較強(qiáng)的致癌性、DNA損傷、免疫炎癥反應(yīng)等生物毒性。3、金屬及氧化物納米材料在不同的環(huán)境因子(老化、UVA輻照、富里酸)影響下,其細(xì)胞毒性也發(fā)生了很大的改變。老化可能增加納米銀和納米氧化鈦的毒性風(fēng)險(xiǎn);FA可能會(huì)降低納米銀和納米氧化鈦的生物毒性;UVA輻照對(duì)納米材料生物毒性的影響與材料種類有關(guān)。4、結(jié)合傳統(tǒng)的生物毒性檢測(cè)方法,細(xì)胞生物傳感器初步檢測(cè)了納米氧化鈦的細(xì)胞毒性和基因毒性。結(jié)果顯示,5 nm、15 nm氧化鈦未檢測(cè)出明顯的細(xì)胞活力或存活率的下降;15nm氧化鈦增加了胞內(nèi)AP-1、BTG2和IL8基因的轉(zhuǎn)錄活性,可能具有較高的致癌毒性、DNA損傷、細(xì)胞炎癥等毒性效應(yīng);15 nm氧化鈦引起了較高的DNA損傷,但并未導(dǎo)致基因突變,可能是由于及時(shí)啟動(dòng)了胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制,完成了損傷修復(fù),也未導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生基因突變。
[Abstract]:Nanomaterials are typically very thin materials with a feature size of 1-100nm, and are easily accessible to the organism by inhalation, ingestion and skin contact. The variety of nano-materials has wide application in the commercial products such as coatings, catalysts, semiconductors, cosmetics, food additives, electronic components and drug carriers. The research shows that as the opportunity of the human body to contact the nano-material is increased, the effect of the nano-material on the human can lead to a series of biological reactions. As a result, the biological safety of the nano-material is attracting more and more attention. At present, the nano-toxicology has not set up a set of independent and perfect method for evaluating the toxicity of the nano-material. and the unique particle effect of the nano-material is urgent to develop an accurate, high-efficiency, simple and convenient method for detecting the toxicity of the nano material. A double-fluorescence reporter plasmid (pAP1-MC-EGFP, pBTG2-MC-EGFP and pIL8-MC-EGFP) based on AP-1, BTG2 and IL8 was constructed. The green fluorescent protein (EGFP) and the green fluorescent protein (EGFP) were controlled by using the green fluorescent protein (EGFP) and the red-burning light protein mCherry as the reporter gene. while the inducible promoter (AP-1, BTG2, or IL8 promoter) controls the downstream red fluorescent protein mCherry expression. The constitutively expressed EGFP is used to monitor the transfection efficiency, while the inducible expression mCherry fluorescence signal is used to accurately reflect the activity of the promoter. The three double-fluorescent reporter gene plasmids are respectively transfected into mammalian cells, and corresponding cell biological sensors are established for reflecting the carcinogenic toxicity, the DNA damage and the inflammatory reaction. Through the optimization of the cell biosensor, it is successfully applied to the evaluation of the biological toxicity effect of the nano-material and the effect of the environmental factor on the biological toxicity of the nano-material, and the regulation mechanism of the gene expression in the cell under the exposure of the nano-material is primarily discussed, so as to provide important information for researching the expression of a specific gene in the cell. At the same time, the cytotoxicity and genotoxicity of the nano-titanium oxide were investigated by using the cell biosensor in combination with the traditional methods of biological toxicity detection. The main results of this paper are as follows: 1. The novel double-fluorescence reporter plasmid pAP1-MC-EGFP, pBTG2-MC-EGFP, pIL8-MC-EGFP are constructed, and the effects of cell type, culture conditions, flow analysis strategy and the like on the detection results are established. The experimental system for detecting the biological toxicity of the nano-material by the cell biosensor was optimized. and the detection sensitivity and the accuracy are remarkably improved. at the same time, compared with the experimental results obtained by the conventional biological detection method (Western Blot, RT-PCR, immunofluorescence cell chemistry), the cell biosensor detection result is good with that of the cell biosensor, and 2, flow cytometry is utilized, and the cell biosensor is successfully applied to the detection of the biological toxicity of the nano material. The results showed that the difference of gene transcription activity caused by different kinds of nano-materials was very different. in which, the carbon family nano material basically does not influence the transcriptional activity of the intracellular AP-1, and the metal and the metal oxide nano material increase the transcriptional activity of the three promoters in the cell and has a concentration dependence, and has the biological toxicity of strong carcinogenicity, DNA damage, immune inflammation reaction and the like. The cytotoxicity of metal and oxide nano-materials under different environmental factors (aging, UVA irradiation and rich acid) has also changed greatly. aging may increase the toxicity risk of the nano-silver and the nano-titanium oxide; the fa can reduce the biological toxicity of the nano-silver and the nano-titanium oxide; the effect of uva irradiation on the biological toxicity of the nano-material is related to the material species; and 4, in combination with the traditional biological toxicity detection method, The cytotoxicity and genotoxicity of the nano-titanium oxide were preliminarily detected by the cell biosensor. The results showed that 5 nm and 15 nm of titanium oxide did not detect a significant decrease in cell viability or survival rate; 15nm titanium oxide increased the transcriptional activity of the intracellular AP-1, BTG2 and IL8 genes, and could have higher toxic effects such as carcinogenicity, DNA damage, cell inflammation, etc. The 15-nm titanium oxide induced higher DNA damage, but did not lead to a gene mutation, possibly due to the timely initiation of the intracellular DNA repair mechanism, the completion of the injury repair, and the failure of the cell to cause a gene mutation.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78;TB383.1;X171.5

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本文編號(hào)：2411782